參附配伍對心肌細胞減毒作用的機制研究.pdf

1、中藥復方是中醫(yī)用藥的主要形式，藥物通過配伍組合，組分間相互作用，產(chǎn)生單一藥物無法達到的療效。但正因為成分的復雜多樣，導致中藥復方治療疾病的靶點多樣，作用機制不明確，成為中藥復方走向世界的阻力之一。本課題主要以參附方為對象進行研究，探索附子毒性作用的途徑和機制，研究參附配伍組分減毒作用的機制。
　　本文首先以附子水提取液6.25,12.5,25,50,100 g·L-1作用于H9c2細胞24h，熒光染色和CCK-8法檢測細胞存活率；

2、附子水提取液6.25,12.5,25 g·L-1作用于H9c2細胞24h，流式細胞儀檢測線粒體膜電位、活性氧（ROS）生成量的變化；使用相應的熒光探針，結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)Ca2+、線粒體內(nèi)Ca2+以及線粒體內(nèi)超氧化物的變化；檢測細胞內(nèi)ATP濃度變化；實時熒光定量PCR檢測過氧化物酶體增殖活化受體共激活因子-1α（Pgc-1α）, Bcl-2和Bax mRNA的表達；Western蛋白印跡法檢測Pgc-1α蛋白的表達；We

3、stern blot檢測PGC-1α蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)附子水提取液12.5~100 g·L-1作用于H9c2細胞，可以顯著抑制細胞活性（P＜0.05），IC50值為47.4669g·L-1，95％的可信限32.5997~69.1145 g·L-1。附子水提取液25 g·L-1處理后 ROS的熒光強度由空白對照組的203.7±66.8升高到453.5±78.3（P＜0.05），線粒體超氧化物的熒光強度由5.35±1.77升高到26.82±8

4、.52（P＜0.01），線粒體膜電位由1.72±0.46下降到0.836±0.39（P＜0.05），線粒體內(nèi)Ca2+的熒光強度由37.96±4.31下降到9.24±1.65（P＜0.01），細胞內(nèi)Ca2+的熒光強度由7.82±0.79升高到22.07±0.51（P＜0.05），細胞內(nèi)ATP濃度由（10.56±0.39）μmol·g-1蛋白下降到（5.27±1.06）μmol·g-1蛋白（P＜0.05）。實時熒光定量 PCR和Wester

5、n蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，附子水提取液25 g·L-ee1組Pgc-1αee和 Bcl-2的mRNA相對表達量分別由空白對照組的1±0.10和1±0.10下降到0.086±0.062（P＜0.01）和0.429±0.059（P＜0.01）, Bax的mRNA相對表達量由1±0.031升高到1.1725±0.06（P＜0.05）；Pgc-1α蛋白的表達量由空白對照組的0.906±0.034下降到0.541±0.003（P＜

6、0.01）。實驗結(jié)果表明附子對心肌細胞具有一定的線粒體毒性，其作用是多種途徑共同作用的結(jié)果。附子的心肌線粒體毒性可能是附子造成心肌毒性的原因。
　　其次，通過考察烏頭堿、人參皂苷Re及CaMKⅡ抑制劑KN-93對心肌細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響，對 CaMKⅡ及相關(guān)鈣調(diào)控蛋白基因和蛋白表達水平的影響，探索烏頭堿致心律失常的機制以及人參皂苷 Re的保護機制。各組先使用 Fluo-4AM負載后進行藥物處理，進行鈣離子動態(tài)實時監(jiān)測；藥物處理后實

7、時熒光定量 PCR檢測RyR2 mRNA的表達；Western blot檢測CaMKⅡ、P-CaMKⅡRyR2及SERCA2蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)烏頭堿處理心肌細胞后能夠引起心肌細胞鈣瞬變的頻率增加以及相對Ca2+含量升高，從而導致心肌細胞內(nèi)鈣紊亂，這種作用能夠被維拉帕米（鈣通道阻滯劑）及KN93（CaMKⅡ抑制劑）所抑制，說明烏頭堿所引起的心率失?？赡芘cCaMKⅡ有關(guān)。同時，人參皂苷Re能夠降低烏頭堿引起的鈣瞬變頻率增加，鈣瞬變的幅度恢復正

8、常。基因的結(jié)果表明烏頭堿能夠引起肌漿網(wǎng)上的鈣通道RyR2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的增加，蛋白水平的結(jié)果顯示，烏頭堿能夠引起 CaMKⅡ磷酸化水平和RyR2蛋白表達水平升高，這種現(xiàn)象能夠被KN-93以及人參皂苷Re逆轉(zhuǎn)。實驗結(jié)果表明了烏頭堿所引起的心率失?？赡芘c增加了 CaMKⅡ的磷酸化有關(guān)；同時，結(jié)果也表明了人參皂苷Re能夠通過降低CaMKⅡ磷酸化對抗烏頭堿引發(fā)的心律失常。
　　本文首次揭示了附子的線粒體毒性；通過參附中有效成分之間的配