白樺脂醇對(duì)受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指心肌血流中斷或下降一段時(shí)間后恢復(fù)血流供應(yīng)，造成功能障礙、結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括氧自由基、鈣超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體功能障礙等，而不同路徑又通過(guò)各種細(xì)胞因子形成網(wǎng)狀交互作用，共同加重細(xì)胞損傷。近年來(lái)，心肌炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視。多種因素或應(yīng)激都可使心肌表達(dá)并分泌促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細(xì)胞

2、介素1(IL-1)，白細(xì)胞介素6(IL-6)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細(xì)胞粘附分子-1（ICAM-1）等，這些細(xì)胞因子通常會(huì)導(dǎo)致NF-κ3信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。
　　核因子κB(NF-κ∈B)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的炎癥調(diào)控因子。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，NF-κB被激活后從細(xì)胞漿易位至細(xì)胞核內(nèi)與特異性的DNA結(jié)合，繼而誘導(dǎo)其下游多種炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，增加心肌損傷。因此，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控對(duì)于心肌細(xì)胞炎癥

3、反應(yīng)有重要的意義。
　　信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)廣泛參與了細(xì)胞應(yīng)激、生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)。多項(xiàng)研究表明，STAT3參與多種心臟生理、病理活動(dòng)，如心肌細(xì)胞存活、心肌血管再生、線(xiàn)粒體能量代謝、細(xì)胞外基質(zhì)變化及炎癥反應(yīng)等。STAT3的缺乏會(huì)引起心肌細(xì)胞炎癥和心肌纖維化，增加心功能衰竭的發(fā)生。
　　白樺脂醇(betulin)是從白樺樹(shù)皮提取的一種天然有機(jī)化學(xué)藥物，可以轉(zhuǎn)化為白樺脂酸，具有多種生物活性如

4、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗HIV等作用，引起了人們極大的研究興趣。近期研究還發(fā)現(xiàn)白樺酯醇能通過(guò)抑制膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)同時(shí)降低膽固醇和三酰甘油，改善肥胖患者的高脂血癥和胰島素抵抗，對(duì)2型糖尿病的治療效果明顯。但目前對(duì)白樺脂醇對(duì)心肌細(xì)胞損傷的作用還缺乏研究。
　　本研究的目的是探討白樺脂醇對(duì)損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其信號(hào)機(jī)制。鑒于炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中的重要作用，課題主要集中于兩部分實(shí)驗(yàn)。第一部分構(gòu)建大鼠

5、離體心臟灌流模型，探討白樺脂醇預(yù)處理對(duì)缺血再灌注后心肌細(xì)胞炎癥的抵抗作用;第二部分以人源心肌細(xì)胞AC16為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從炎癥反應(yīng)的角度探討白樺脂醇對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子信號(hào)機(jī)制。
　　第一部分：白樺脂醇抵抗心肌細(xì)胞炎癥的作用
　　目的：
　　探討白樺脂醇預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注后心肌細(xì)胞炎癥的抵抗作用。
　　方法：
　　將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。麻醉后快速游離出心臟，置于Langendorff

6、灌流架上，經(jīng)主動(dòng)脈插管進(jìn)行灌流。①假缺血再灌注組（Sham）:心臟用K-H液持續(xù)灌流120min。②缺血再灌注模型組(Model):心臟用K-H液平衡灌流50min后，停灌30min再重新灌流K-H液40min。③三個(gè)不同濃度的白樺脂醇(Betulin:25/50/100mg/L)預(yù)處理組:心臟用K-H液平衡灌流10min后，分別用含有相應(yīng)濃度白樺脂醇的K-H液灌流5min后，再用不含白樺脂醇的K-H液灌5min，如此反復(fù)，共4次，以后

7、的處理同Model組。
　　灌流結(jié)束后從心尖部剪下一小塊心肌組織，立即置于10％的多聚甲醛溶液置于4℃冰箱中，后續(xù)進(jìn)行心肌組織病理HE染色、TTC染色測(cè)定、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和免疫組化測(cè)定TNF-α、ICAM-1和NF-κB表達(dá)水平;取下剩余的大部分左心室心肌組織剔除結(jié)締組織，制做成心肌勻漿，放入-20℃保存，采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)LDH、CK和MPO活力等生化指標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　1、Model組大鼠心肌組織中C

8、K的活力為14.29±2.08kU/g蛋白，LDH活力為1027±66U/g蛋白，均較Sham組明顯降低(P＜0.01);Betulin組可以濃度依賴(lài)性抑制I/R損傷后大鼠心肌組織中CK和LDH漏出入血，尤以Betulin100mg/L組作用更為明顯，CK和LDH活性較Model組明顯增高(P＜0.01)，為22.42±1.44kU/g蛋白和1691±79U/g蛋白。
　　2、與Sham組相比，Model組出現(xiàn)大面積的心肌梗死（I

9、S/AAR％=42.13±6.27），白樺脂醇100mg/L預(yù)處理后心肌梗死的面積（IS/AAR％=18.54±4.92）較Model組明顯減小(P＜0.01)，心肌損傷減輕。
　　3、心肌組織HE染色鏡下可見(jiàn)Model組中大鼠心肌纖維出現(xiàn)明顯的波紋狀變和心肌收縮帶，部分纖維斷裂、溶解;Betulin組損傷變化較輕，肌原纖維排列基本整齊，肌節(jié)基本完整，沒(méi)有收縮帶和波紋狀變等特征性變化。
　　4、與Sham組相比，Model組

10、TUNEL染色最強(qiáng)，而經(jīng)過(guò)白樺脂醇預(yù)處理后，TUNEL染色強(qiáng)度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性減弱，表明白樺脂醇可顯著抑制心肌I/R引起的細(xì)胞凋亡。
　　5、Model組炎癥因子NF-κB、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)明顯增加，陽(yáng)性反應(yīng)的平均灰度值較Sham組增高顯著(P＜0.01);和Model相比，Betulin組NF-κB、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)均有所降低，以100mg/L組作用更加明顯(P＜0.01)。
　　6、Sham組大

11、鼠心肌組織勻漿中MPO的活力很低（0.15±0.007U/g蛋白），而Model組的MPO活力(0.87±0.012U/g蛋白)較Sham組明顯增高(P＜0.01);而各Betulin組心肌組織中MPO的活力較Model降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　白樺脂醇預(yù)處理可以減輕大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌組織缺血再灌注損傷。
　　第二部分：白樺脂醇改善心肌細(xì)胞炎癥的分子機(jī)制研究
　　目的：
　　探討白

12、樺脂醇改善人源心肌細(xì)胞AC16的炎癥反應(yīng)及分子信號(hào)機(jī)制。
　　方法：
　　AC16細(xì)胞是購(gòu)自ATCC從成人心室肌細(xì)胞衍生而來(lái)的細(xì)胞株，以低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)融合后分瓶，漂洗、離心出細(xì)胞懸液，分裝于培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％時(shí)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)處理，然后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞，于-80℃冰箱凍存檢測(cè)。
　　1、給予空白對(duì)照和白樺脂醇4小時(shí)后，加入TNF-α賦予，收集細(xì)胞上清，通過(guò)EILSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-6和

13、MCP-1的蛋白濃度，收取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)IL-6、MCP-1、IL-1β等炎癥基因的表達(dá)。
　　2、在AC16細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒，并給予TNF-α和白樺脂醇刺激。用熒光素酶報(bào)告和p65抗體ChIP實(shí)驗(yàn)對(duì)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的基因表達(dá)進(jìn)行分析，以評(píng)估白樺脂醇對(duì)NF-κB在AC16細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　3、白樺脂醇孵育AC16細(xì)胞后，對(duì)STAT3的磷酸化和其下游靶基因SO

14、CS3、BCL-xL的水平進(jìn)行了檢測(cè)，以評(píng)估STAT3的活化。
　　4、通過(guò)加入STAT3通路的抑制劑AG490和小RNA干擾片段，以檢測(cè)STAT3通路是否是白樺脂醇的抗炎效應(yīng)所必須的。
　　結(jié)果：
　　1、TNF-α能顯著提高AC16細(xì)胞中IL-6，MCP-1和IL-1β的mRNA表達(dá)水平，而白樺脂醇能顯著抑制TNF-α所誘導(dǎo)的該炎癥基因的表達(dá)，細(xì)胞中IL-6和MCP-1的蛋白濃度也低于對(duì)照組。
　　2、TNF

15、-α能顯著激活NF-κB報(bào)告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)P65在核內(nèi)的積聚、磷酸化和乙酰化，而白樺脂醇則顯著抑制TNF-α的作用，阻斷NF-κB信號(hào)在AC16細(xì)胞內(nèi)的活化。
　　3、白樺脂醇孵育AC16細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)STAT3磷酸化增強(qiáng)，下游基因-SOCS3和BCL-xL基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)，證實(shí)該過(guò)程中存在STAT3通路的激活。
　　4、給予STAT3抑制劑AG490后，白樺脂醇對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-6和MCP-1的表達(dá)抑制作用減