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1、目的:烏頭(附子)是我國臨床常用的重要中藥?,F(xiàn)代藥理學研究表明烏頭及附子具有強心、升壓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用。同時它具有很大毒性。烏頭堿既是烏頭(附子)的主要有效成分,又是主要毒性成分。目前,烏頭類中藥在文獻研究中廣泛報道的主要是心臟毒性(心律失常)和中樞神經(jīng)毒性方面的研究,而對遺傳毒性的研究很少。最新研究指出烏頭堿能導致心肌細胞DNA損傷,但其DNA損傷機制的研究尚未見報道。本課題采用原代培養(yǎng)的心肌細胞從細胞內(nèi)的鈣超載和活性氧升高
2、的角度探討烏頭堿致DNA損傷的機制,將為闡明烏頭堿心肌毒性的分子機制及其合理用藥奠定理論基礎(chǔ)。 方法:在本研究中,利用免疫熒光法鑒定原代培養(yǎng)的心肌細胞純度;采用噻唑藍比色法(MTT法)測定烏頭堿對原代培養(yǎng)的心肌細胞活力與藥物作用的量效和時效關(guān)系;利用單細胞凝膠電泳法(SCGE法)-彗星試驗法,檢測不同劑量的烏頭堿對心肌細胞DNA的損傷;機理研究中,利用流式細胞儀檢測烏頭堿對原代培養(yǎng)的心肌細胞中的活性氧(ROS)與藥物作用的時效和
3、量效關(guān)系,并檢測抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和維生素E(VE)和肌漿網(wǎng)鈣通道抑制劑釕紅(RR)預處理后烏頭堿對細胞內(nèi)ROS的影響;并通過單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測抗氧化劑和鈣抑制劑預處理后烏頭堿對細胞的DNA損傷的影響。 結(jié)果:我們原代培養(yǎng)的心肌細胞的純度達95%;烏頭堿導致心肌細胞活力下降,具有一定的量效和時效關(guān)系,3μM烏頭堿作用60 min,心肌細胞活力為對照組的45%:烏頭堿導致心肌細胞DNA損傷,呈劑量依賴性,烏頭堿
4、各劑量組與空白組相比,尾部DNA百分含量和尾矩均有顯著差異;機理研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿導致心肌細胞內(nèi)活性氧明顯升高,具有一定的量效關(guān)系,3μM烏頭堿作用細胞不同時間后,胞內(nèi)的活性氧在90 min達到最大值;抗氧化劑NAC、VE和肌漿網(wǎng)鈣通道抑制劑RR預處理后,能夠明顯減少烏頭堿誘導的心肌細胞內(nèi)活性氧的增加;抗氧化劑NAC、VE和肌漿網(wǎng)鈣通道抑制劑RR預處理后,能夠明顯減弱烏頭堿誘導的心肌細胞DNA損傷。 結(jié)論: 1、烏頭堿抑制
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