腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、目的：卵巢癌的鉑類耐藥是造成腫瘤復(fù)發(fā)和死亡率居高不下的重要原因。腫瘤微環(huán)境與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)，而腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的細(xì)胞，本課題擬從卵巢癌組織中分離并鑒定CAFs，深入探討CAFs與上皮性卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系及其分子機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥提供新的思路。
　　方法：通過(guò)組織塊爬行法和酶消化法從卵巢癌組織中提取CAFs，利用

2、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CAFs中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin和CAFs的特異性標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)情況；利用Western blot技術(shù)檢測(cè)CAFs中上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK-8的表達(dá)水平。收集CAFs的培養(yǎng)上清（CAFs-CM），與新鮮培養(yǎng)基以1:1或2:1的比例混合制備共培養(yǎng)的混合培養(yǎng)基（Mix1:1和Mix2:1）；利用CCK-8技術(shù)檢測(cè)在正常培養(yǎng)基（Normal）、Mix1:1和Mix2:1培養(yǎng)條件下上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780和ES2中

3、順鉑的半數(shù)抑制濃度（IC50值）；運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在以上三種培養(yǎng)條件下順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率；利用Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在以上培養(yǎng)條件下凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3及其剪切體cleaved caspase-3的水平、抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)及二者的上游調(diào)控者STAT3的磷酸化(p-STAT3)水平。加入STAT3的抑制劑Cryptotanshinone驗(yàn)證Cryptotanshinone能否逆轉(zhuǎn)

4、CAFs-CM培養(yǎng)條件下的A2780和ES2細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性、順鉑誘導(dǎo)的凋亡率及抗凋亡蛋白 Bcl-2、Survivin及 p-STAT3的表達(dá)。
　　結(jié)果：從卵巢癌組織中提取的CAF s高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 vimenti n和CAFs的特異性標(biāo)志物α-SM A，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物 CK-8陰性；CAFs-C M使得A2780和 ES2細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值逐漸增高（P<0.05），且增高程度與 CAFs-CM的濃度成正比,提示

5、 CAFs-CM促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞耐藥并呈濃度依賴性；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn) CAFs-CM抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P<0.05），細(xì)胞在正常培養(yǎng)基（Normal）、混合培養(yǎng)基 Mix1:1和 Mix2:1中的凋亡率分別為：A2780細(xì)胞中Normal組20.02±1.69％； Mix1:1組9.19±0.72%； Mix2:1組3.27±0.75%；ES2細(xì)胞中 Normal組21.73±1.62%；Mix1:1組13±1.56%；Mix2:1

6、組6.47±0.67%；可以看出CAFs-CM抑制細(xì)胞凋亡也呈CAFs-CM濃度依賴性。同時(shí)，CAFs-CM抑制凋亡執(zhí)行蛋白 caspase-3的活化，促進(jìn)抗凋亡蛋白 Bcl-2、Survivin及p-STAT3的表達(dá)（P<0.05）。加入STAT3抑制劑Cryptotanshinone逆轉(zhuǎn)了 CAFs-CM培養(yǎng)下的細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生的耐藥性（P<0.05），同時(shí)Cryptotanshinone可以促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P<0.05），抑