等位基因特異性PCR檢測(cè)HIV-1 CRF_01AE亞型耐藥突變方法的建立.pdf

1、目的:
　　根據(jù)等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR，ASPCR)原理設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)廣西HIV-1 CRF01 AE亞型pol基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)主要耐藥突變，探索利用ASPCR法檢測(cè)艾滋病耐藥位點(diǎn)的可行性，為臨床耐藥檢測(cè)和耐藥流行病學(xué)調(diào)查提供快速、靈敏、高效、低成本的檢測(cè)技術(shù)。
　　方法:
　　利用不含耐藥突變HIV-1 CRF01_AE亞型pol基因片段和pUCm-T載體，構(gòu)建HIV-1 CRF0

2、1_AE亞型pol基因野生型質(zhì)粒。對(duì)所構(gòu)建的野生型克隆質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得含耐藥突變位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒。根據(jù)ASPCR原理，設(shè)計(jì)通用下游引物以及針對(duì)每一突變位點(diǎn)的特異性上游引物，包含野生型檢測(cè)引物和突變型檢測(cè)引物。以構(gòu)建的野生型質(zhì)粒和各種突變型質(zhì)粒為模板，使用PCR法評(píng)價(jià)所設(shè)計(jì)的引物，篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物。選取少量艾滋病HARRT治療患者，同時(shí)使用直接測(cè)序法和ASPCR法檢測(cè)耐藥突變，通過比較驗(yàn)證引物的有效性。
　　結(jié)果

3、:
　　1.成功構(gòu)建含HIV CRF01_AE亞型pol基因的PUCm-T質(zhì)粒，包括不含耐藥突變的野生型質(zhì)粒和19個(gè)含逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒，所有克隆經(jīng)過測(cè)序鑒定;
　　2.針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)19個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一條通用下游引物以及每一位點(diǎn)的野生型引物和突變型引物各兩條。19個(gè)突變位點(diǎn)包括NRTIs耐藥突變10個(gè)，分別為M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y、T

4、215F; NNRTIs耐藥突變9個(gè)，分別是K103N、V108I、E138A、V179D、 Y181C、 Y188C、 G190A、G190R、M230I;
　　3.在19個(gè)耐藥位點(diǎn)中，有15個(gè)位點(diǎn)分別篩選出一條特異性良好的野生型引物，其中，M184V位點(diǎn)和M184I位點(diǎn)、G190R位點(diǎn)和G190A位點(diǎn)、T215Y位點(diǎn)和T215F位點(diǎn)的野生型引物相同。有16個(gè)位點(diǎn)分別篩選出一條靈敏度高的突變型引物，其中3個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度達(dá)1％

5、突變樣本，9個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度達(dá)5％突變樣本，4個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度達(dá)10％突變樣本;
　　4.23例臨床樣本中，采用直接測(cè)序法檢出6例K103N突變、9例Y181C突變和5例G190A突變。采用本項(xiàng)目建立的ASPCR法檢出4例K103N突變、7例Y181C突變和5例G190A突變，與測(cè)序法的一致性分別為66.6％、77.8％和100％。
　　結(jié)論:
　　本研究探索了基于ASPCR原理建立HIV-1耐藥突變檢測(cè)方法，成功