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文檔簡介
1、背景:DNA甲基化對轉錄的抑制作用是表觀遺傳學中一項非常重要的內容。人類基因組中約有29000個CpG島,超過60﹪的基因啟動子和第一外顯子都包含CpG島。DNA甲基化與腫瘤的關系正日益引起人們的關注,檢測DNA的異常甲基化有助于深入理解腫瘤形成機制,并且可為腫瘤的早期診斷、病理分型、療效評估及復發(fā)監(jiān)測等提供十分重要的信息。 2004年我國衛(wèi)生部提供的資料顯示肺癌的發(fā)病率與死亡率已居惡性腫瘤之首。APC基因,即腺瘤性結腸息肉病相
2、關基因(ademomatouspolyposiscoli,APC),其蛋白質的表達在肺癌中降低,卻很少發(fā)現(xiàn)突變。 目的:建立含有弱陽性質控品的甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR,MSP)檢測技術。研究APC基因甲基化對轉錄的影響及其與肺癌的關系。 方法:酚-氯仿法提取臍帶血淋巴細胞DNA,轉甲基制備陽性模板,化學修飾,MSP后獲得目的片段,克隆到pMD18-T質粒載體,測序篩選陽性和陰性質粒
3、,紫外分光光度法對陽性質粒定量,優(yōu)化MSP的各項參數(shù),制備弱陽性質控品。用建立的MSP技術分析103份DNA標本的甲基化狀態(tài),這其中包括:39例肺癌病例(78份DNA);2例肺部其他腫瘤病例(4份DNA);18例正常人標本(14份肺組織DNA,4例門診血的淋巴細胞DNA);3株肺癌細胞。Trizol法提取組織和細胞RNA,以β-actin為內參照,SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測肺癌患者的腫瘤組織相對其正常組織的APC表達量
4、。分析研究APC甲基化狀態(tài)與基因表達、年齡、臨床分期、病理分級、吸煙史、預后的關系,結果用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結果: 測序結果顯示陽性質粒所有CpG中的C保持不變,其余的C均變?yōu)門。MSP反應體系的最佳Mg2+濃度為2.0mM,最佳引物濃度為200nM。MSP的敏感性為105拷貝/ml,其濃度對應的陽性質粒為弱陽性質控品。 利用已建立的MSP方法,共檢測了103份DNA標本的甲基化狀態(tài),其中肺癌患
5、者的肺正常組織陽性率為30.8﹪(12/39),腫瘤組織陽性率為66.7﹪(26/39)。1例硬化性血管瘤的肺組織、1例惡性淋巴瘤病例的肺組織和14例正常人肺組織均無甲基化,另外4例門診血的淋巴細胞均無甲基化,3株肺癌細胞中NCI-H460陽性,而SPC-A1和NCI-H446陰性。統(tǒng)計學分析顯示:肺癌患者腫瘤組織的APC基因甲基化率高于相應正常組織,P=0.001。肺癌患者正常肺組織較正常人肺組織APC基因的甲基化率高,P=0.023
6、。肺癌患者腫瘤肺組織較正常人肺組織APC基因的甲基化率高,P=0.000。肺癌患者腫瘤組織相對其正常肺組織的APC基因表達量為0.281,88.0﹪的肺腫瘤組織甲基化陽性標本的APC基因表達降低,P=0.005。APC基因甲基化與年齡和預后之間有統(tǒng)計學意義。 結論:本研究建立了抑癌基因APC基因啟動子1A序列的MSP檢測技術。構建了攜帶甲基化陽性的APC基因啟動子的質粒并制備了弱陽性質控品,對MSP檢測靈敏度進行質量控制,降低了
7、檢測的假陰性率。肺癌細胞株H460的APC基因甲基化陽性,這在國內外尚未見報道。 APC基因甲基化導致其表達降低,而表達的降低則導致Wnt信號通路和細胞骨架等的紊亂,這引發(fā)了細胞的癌變,導致肺癌發(fā)生,并伴隨著肺癌的進展,導致預后不良。APC基因甲基化隨著年齡的增加有增高的趨勢;APC基因在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用;APC基因發(fā)生甲基化的病人預后不良。這些都提示APC基因的甲基化可能是肺癌早期診斷和預后的新分子標志物,其具
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