APC基因甲基化特異性PCR檢測方法的建立及其在肺癌診斷中的應用.pdf

1、背景：DNA甲基化對轉錄的抑制作用是表觀遺傳學中一項非常重要的內容。人類基因組中約有29000個CpG島，超過60﹪的基因啟動子和第一外顯子都包含CpG島。DNA甲基化與腫瘤的關系正日益引起人們的關注，檢測DNA的異常甲基化有助于深入理解腫瘤形成機制，并且可為腫瘤的早期診斷、病理分型、療效評估及復發(fā)監(jiān)測等提供十分重要的信息。 2004年我國衛(wèi)生部提供的資料顯示肺癌的發(fā)病率與死亡率已居惡性腫瘤之首。APC基因，即腺瘤性結腸息肉病相

2、關基因(ademomatouspolyposiscoli，APC)，其蛋白質的表達在肺癌中降低，卻很少發(fā)現(xiàn)突變。 目的：建立含有弱陽性質控品的甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)檢測技術。研究APC基因甲基化對轉錄的影響及其與肺癌的關系。 方法：酚-氯仿法提取臍帶血淋巴細胞DNA，轉甲基制備陽性模板，化學修飾，MSP后獲得目的片段，克隆到pMD18-T質粒載體，測序篩選陽性和陰性質粒

3、，紫外分光光度法對陽性質粒定量，優(yōu)化MSP的各項參數(shù)，制備弱陽性質控品。用建立的MSP技術分析103份DNA標本的甲基化狀態(tài)，這其中包括：39例肺癌病例(78份DNA)；2例肺部其他腫瘤病例(4份DNA)；18例正常人標本(14份肺組織DNA，4例門診血的淋巴細胞DNA)；3株肺癌細胞。Trizol法提取組織和細胞RNA，以β-actin為內參照，SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測肺癌患者的腫瘤組織相對其正常組織的APC表達量

4、。分析研究APC甲基化狀態(tài)與基因表達、年齡、臨床分期、病理分級、吸煙史、預后的關系，結果用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結果： 測序結果顯示陽性質粒所有CpG中的C保持不變，其余的C均變?yōu)門。MSP反應體系的最佳Mg2+濃度為2.0mM，最佳引物濃度為200nM。MSP的敏感性為105拷貝/ml，其濃度對應的陽性質粒為弱陽性質控品。 利用已建立的MSP方法，共檢測了103份DNA標本的甲基化狀態(tài)，其中肺癌患

5、者的肺正常組織陽性率為30.8﹪(12/39)，腫瘤組織陽性率為66.7﹪(26/39)。1例硬化性血管瘤的肺組織、1例惡性淋巴瘤病例的肺組織和14例正常人肺組織均無甲基化，另外4例門診血的淋巴細胞均無甲基化，3株肺癌細胞中NCI-H460陽性，而SPC-A1和NCI-H446陰性。統(tǒng)計學分析顯示：肺癌患者腫瘤組織的APC基因甲基化率高于相應正常組織，P=0.001。肺癌患者正常肺組織較正常人肺組織APC基因的甲基化率高，P=0.023

6、。肺癌患者腫瘤肺組織較正常人肺組織APC基因的甲基化率高，P=0.000。肺癌患者腫瘤組織相對其正常肺組織的APC基因表達量為0.281，88.0﹪的肺腫瘤組織甲基化陽性標本的APC基因表達降低，P=0.005。APC基因甲基化與年齡和預后之間有統(tǒng)計學意義。 結論：本研究建立了抑癌基因APC基因啟動子1A序列的MSP檢測技術。構建了攜帶甲基化陽性的APC基因啟動子的質粒并制備了弱陽性質控品，對MSP檢測靈敏度進行質量控制，降低了

7、檢測的假陰性率。肺癌細胞株H460的APC基因甲基化陽性，這在國內外尚未見報道。 APC基因甲基化導致其表達降低，而表達的降低則導致Wnt信號通路和細胞骨架等的紊亂，這引發(fā)了細胞的癌變，導致肺癌發(fā)生，并伴隨著肺癌的進展，導致預后不良。APC基因甲基化隨著年齡的增加有增高的趨勢；APC基因在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用；APC基因發(fā)生甲基化的病人預后不良。這些都提示APC基因的甲基化可能是肺癌早期診斷和預后的新分子標志物，其具