HIV-1單純及合并HCV感染對(duì)HIV-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響.pdf

1、人類免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Virus Type1，HIV-1）與丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）合并感染的臨床治療和相關(guān)致病機(jī)制研究是目前臨床面臨的難題和研究熱點(diǎn)。由于HIV-1和HCV的傳播途徑相同，均通過血液及血液制品、性途徑、母嬰途徑傳播，HIV-1/HCV合并感染的現(xiàn)象非常普遍。隨著高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly Active Anti-Retroviral

2、 Therapy,HAART)在艾滋病中的廣泛和規(guī)范應(yīng)用，機(jī)會(huì)性感染的發(fā)病率和死亡率都已顯著下降，而合并HCV感染所致的肝損害已經(jīng)成為艾滋病患者死亡的主要原因之一；抗HCV治療的低有效率和HAART治療中不良反應(yīng)的增加；中國(guó)國(guó)內(nèi)流行的HCV基因型及準(zhǔn)種復(fù)雜而又難治，這些都使得對(duì)HIV-1/HCV合并感染者的治療更加棘手。但究其原因，至今并不完全明了，很有必要從病毒學(xué)和免疫學(xué)角度對(duì)HIV-1/HCV合并感染者進(jìn)行深入研究。
　　既往

3、很多研究已證實(shí)細(xì)胞因子在HIV-1感染疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要的作用，有研究表明：在HIV-1感染過程中IL-4可抑制體內(nèi)的病毒水平，IL-7對(duì)維持淋巴細(xì)胞的存活發(fā)揮了重要的作用，IL-17可能參與HIV-1病毒的免疫反應(yīng)，IL-21可以促使 CD8+T細(xì)胞增殖及保持活性，IFN-γ是機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的重要細(xì)胞因子之一。我們推測(cè)合并HCV感染會(huì)對(duì)HIV-1感染者上述細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，而有關(guān)HCV合并感染對(duì)HIV-1感染者上述細(xì)胞

4、因子的影響闡述得并不多，所以有必要對(duì)HCV合并感染對(duì)HIV-1感染者上述細(xì)胞因子的分泌狀況展開研究。
　　既往有關(guān)HIV-1感染和HCV感染的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究，結(jié)果均提示特異性CTL反應(yīng)對(duì)HIV-1感染和HCV感染的控制均具有重要作用，國(guó)內(nèi)外也有少部分關(guān)于 HIV-1/HCV合并感染者的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究報(bào)道。但由于地域和種族的差異，有必要對(duì)華南地區(qū) HIV-1/HCV合并感染者的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行研究。前期我們

5、用ELISPOT方法檢測(cè)HIV-1感染者的CD8+T細(xì)胞對(duì)HIV-1合成表位的免疫主導(dǎo)應(yīng)答發(fā)現(xiàn)：HIV-1 Gag區(qū)域肽段誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞的IFNγ分泌細(xì)胞頻率最高。故我們選用HIV-1 P24區(qū)域（Gag133~191）的氨基酸序列人工合成的12個(gè)重疊肽段組成的肽段庫作為特異性肽段表位，對(duì)HIV-1/HCV合并感染者和HIV-1感染者的HIV-1特異性CTL應(yīng)答進(jìn)行研究。
　　實(shí)驗(yàn)一:HIV-1單純及合并HCV感染的CD

6、4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及PBMC內(nèi)IL-7、IL-21、IFN-γmRNA水平測(cè)定
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象：以中國(guó)華南地區(qū)的已HAART治療的25例HIV-1單純感染和22例HIV-1/HCV合并感染者，及20例健康對(duì)照者為研究對(duì)象。
　　實(shí)驗(yàn)方法：分別采用免疫磁珠分選技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以上述HIV-1 P24區(qū)域重疊肽段庫作為HIV-1特異性肽段表位，刺激從上述三組研究對(duì)象的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分選出的CD4

7、+T淋巴細(xì)胞，CD8+T淋巴細(xì)胞，分別檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞及PBMC在刺激前后IL-7、IL-21、IFN-γ，β-actin的mRNA水平，統(tǒng)計(jì)IL-7、IL-21、IFN-γ與β-actin的比值，并用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：已接受HAART治療的HIV-1單純感染組和HIV-1/HCV合并感染組及健康對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-7、IL-21的mRNA水平比較。
　　P2

8、4抗原表位刺激培養(yǎng)后，HIV-1單純感染組CD8+T細(xì)胞的IFN-γ mRNA水平明顯高于CD4+T細(xì)胞（P<0.05）。無論有無P24特異性抗原表位刺激，健康對(duì)照組PBMC中IFN-γ的mRNA水平均明顯高于HIV-1單純感染組和HIV-1/HCV合并感染組（P<0.05）； P24抗原表位刺激后，HIV-1/HCV合并感染組PBMC中IL-7 mRNA水平明顯高于HIV-1單純感染組（P<0.05）；無論有無P24特異性抗原表位刺激

9、，各組PBMC中 IL-21mRNA水平相比均無明顯差異（P>0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二：ICS檢測(cè)HIV-1單純及合并HCV感染者分泌IL-4，IL-17A，IL-21，IL-21R，IFN-γ的CD3+T淋巴細(xì)胞比例
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象：以未HAART治療的24例HIV-1單純感染者和21例HIV-1/HCV合并感染者，及20例健康對(duì)照組為研究對(duì)象。
　　實(shí)驗(yàn)方法：采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法（intra-cellular C

10、K staining，ICS），以上述HIV-1 P24區(qū)域重疊肽段庫作為特異性肽段表位，刺激上述研究對(duì)象的PBMC，檢測(cè)使用與未使用P24抗原表位刺激后細(xì)胞內(nèi)分泌IL-4、IL-17A、IL-21、IL-21R、IFN-γ的CD3+T淋巴細(xì)胞比例，并用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：未接受HAART治療的HIV-1單純感染組和HIV-1/HCV合并感染組及健康對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)分泌IL-4、IL-17A、IFN-γ、I

11、L-21、IL-21R的T淋巴細(xì)胞比例比較
　　比較使用與未使用P24抗原表位刺激后的結(jié)果顯示，三組T淋巴細(xì)胞內(nèi)的分泌IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-21、IL-21R的比例變化不顯著（P>0.05）。在無P24抗原表位刺激培養(yǎng)后，HIV-1單純感染組的CD3+IL-4+/T淋巴細(xì)胞明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），HIV-1/HCV合并感染組CD3+IL-4+/T淋巴細(xì)胞也高于健康對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）

12、；而在P24抗原表位刺激培養(yǎng)后，三組CD3+IL4+/T淋巴細(xì)胞差異不顯著（P>0.05）。無論有無P24抗原表位刺激培養(yǎng)，HIV-1單純感染組 CD3+IL17-A+/T淋巴細(xì)胞>HIV-1/HCV合并感染組>健康對(duì)照組，且HIV-1單純感染組明顯高于其他兩組（P<0.05）；HIV-1單純感染組CD3+IFN-γ+/T淋巴細(xì)胞>HIV-1/HCV合并感染組>健康對(duì)照組，三組差異不顯著（P>0.05）；三組CD3+IL-21+/T淋巴

13、細(xì)胞差異不顯著（P>0.05）；HIV-1單純感染組CD3+IL-21R+/T淋巴細(xì)胞比例>健康對(duì)照組>HIV-1/HCV合并感染組，HIV-1單純感染組明顯高于其他兩組（P<0.001）。
　　實(shí)驗(yàn)三：ELISPOT檢測(cè)HIV-1單純及合并HCV感染的HIV-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象：以上述實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二中的單純感染者和合并感染者為研究對(duì)象。
　　實(shí)驗(yàn)方法：采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)吸附技術(shù)（enzyme-linke

14、d immunosorbent spot，ELISPOT），以上述HIV-1 P24區(qū)域重疊肽段庫作為特異性肽段表位，分別檢測(cè)研究對(duì)象PBMC中HIV-1特異性CTL應(yīng)答頻數(shù)，并用卡方檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析合并HCV感染對(duì)HIV-1感染細(xì)胞免疫的影響，HAART對(duì)HIV-1感染細(xì)胞免疫的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：HIV-1單純感染組和HIV-1/HCV合并感染組HIV-1特異性CTL應(yīng)答比較
　　已接受HAART治療HIV-

15、1單純感染組HIV-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答率（13/25）明顯高于HIV-1/HCV合并感染組（5/22）（P<0.05）；未接受HAART治療HIV-1單純感染組 HIV-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答率（8/22）高于HIV-1/HCV合并感染組（6/21），但差異不顯著（P>0.05）；已治療單純感染組的HIV-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答率（13/25）高于未治療單純感染組（8/22），但差異不顯著（P>0.05）；已治療合并感染組HIV-1特異性

16、細(xì)胞免疫應(yīng)答率（5/22）與未治療合并感染組（6/21）的相比無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.合并HCV感染可能使HIV-1感染者HIV-1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平下降，這可能是HIV-1/HCV合并感染者HAART治療療效差的原因之一。
　　2.細(xì)胞因子IL-7、IL-17、IL-21R在HIV-1特異性細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。HIV-1感染還可以通過Th17和Tfh途徑影響感染者的細(xì)胞免疫，而HCV