基因突變敏感性分子開關(guān)檢測HIV-1耐藥基因突變.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩66頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:利用高保真聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān),建立對HIV-1七個耐藥突變位進(jìn)行快速篩查的技術(shù)平臺,采用單一PCR和多重PCR相結(jié)合,檢測耐藥基因相關(guān)突變的有無,為HIV耐藥性評估提供依據(jù),指導(dǎo)HIV患者合理用藥。
  方法:將包含HIV-1耐藥突變的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-19-T載體,通過含氨芐的LB平板篩選陽性克隆,挑選菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA。對質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴增初步確定陽性克隆,并通過測序分析確證,獲得包含H

2、IV-1耐藥突變相對應(yīng)的野生型質(zhì)粒模板。突變型模板直接由公司合成,包含目前已知的HIV-1耐藥突變二十七個,本研究選擇七個高頻突變位點建立快速檢測體系。所選七個突變位點分別是M41L(ATG/CTG)、K65R(AAA/AGA)、T69N(ACT/AAT)、M184V(ATG/GTG)、V75I(GTA/ATA)、V82A(GTC/GCC)和L90M(TTG/ATG)。實驗以這七個突變位點為檢測靶點,分別設(shè)計3’末端與野生型基因位點或突

3、變基因位點配對的引物,硫化磷酸修飾3’末端并偶聯(lián)高保真DNA聚合酶構(gòu)成的基因突變敏感性分子開關(guān)。首先在不同體系分別對含有相應(yīng)七個突變的突變質(zhì)粒模板及野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng),并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進(jìn)行分析;然后在同一體系同時對含有相應(yīng)七個突變的突變質(zhì)粒模板及野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng),并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進(jìn)行分析;最后結(jié)合熒光定量分析進(jìn)行檢測。
  結(jié)果:在不同反應(yīng)體系分別對七個熱點突變進(jìn)行檢測。在一定的反應(yīng)條件及反應(yīng)

4、體系下,特異性野生檢測引物與野生模板配對得以延伸;而與突變模板不配對則不能延伸。當(dāng)特異性突變檢測引物與突變模板配對,引物得以延伸;而與野生模板不配對則不能延伸。結(jié)果顯示,使用野生型質(zhì)粒模板,該方法僅能使野生型等位基因相關(guān)引物得以延伸,而突變等位基因位點特異性引物不能被延伸。反之,使用突變質(zhì)粒模板,該方法僅能使突變型等位基因位點相關(guān)引物得以延伸,而野生型等位基因位點特異性引物不能被延伸。在同一反應(yīng)體系同時對以上熱點突變進(jìn)行檢測。同樣,完全

5、配對引物能被延伸,不完全配對引物不能被延伸。分子開關(guān)對上述七個位點的識別敏感性大部分可達(dá)到101~109拷貝,特異性分別為104~105拷貝,這一特定引物擴增特定模板的特異性在突變與野生序列之間的達(dá)到3個或3個以上對數(shù)級,能有效早期檢測耐藥突變。
  結(jié)論:高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)可用于已知基因突變的檢測,除可用于檢測某些遺傳性突變外,還可以檢測耐藥基因突變。高保真DNA聚合酶偶聯(lián)硫化修飾引物構(gòu)成的突變敏感性分子開關(guān)能夠快

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論