丹酚酸B通過SIRT1下調CRP和ChREBP表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷.pdf

1、慢性酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是長期大量飲酒所致的慢性肝臟疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重影響人們的健康生活水平。根據(jù)肝臟病理學改變的不同階段可將 ALD分為：酒精性脂肪肝（Alcoholic fatty liver，AFL）、酒精性肝炎（Alcoholic hepatitis，AH）、酒精性肝纖維化（Alcoholic hepatic fibrosis，AHF）及酒精性肝硬化（Alcoho

2、lic cirrhosis，AC）。目前研究顯示，慢性酒精性肝病的發(fā)病機制十分復雜且治療手段十分有限，因此，研究和掌握 ALD發(fā)病機制并探索有效干預措施具有重要臨床意義。
　　丹酚酸B（Salvianolic acid B，SalB）是丹參根部提取的主要水溶性成分之一，屬于多酚類化合物。研究表明丹酚酸B具有抗氧化、抗炎、抗纖維化及抗癌等多種藥理特性，已廣泛應用于多種疾病的防治，如肝、肺、腎等疾病。丹酚酸B對肝纖維化動物模型具有顯著

3、的保護作用。此外，因其抗炎、抗氧化特性，對心臟及神經(jīng)方面的疾病也具有明顯保護作用。然而丹酚酸B對慢性酒精性肝損傷的保護作用和潛在的分子機制尚未見報道。
　　我們前期研究已證實天然化合物丹酚酸B可影響沉默信息調節(jié)因子2相關酶I（Silent Information Regulator2-related Enzymes1，Sirtuin1，SIRT1)的蛋白表達。SIRT1是廣泛表達于哺乳動物體內的III型組蛋白去乙?；福诙喾N細胞

4、生物學功能中發(fā)揮關鍵的調控作用，如基因轉錄、衰老、能量代謝、氧化還原平衡、炎癥及DNA損傷修復、凋亡。肝細胞核因子1α（Hepatic nuclear factor-1α，HNF-1α）是一種具有同源結構域的轉錄因子，可與復雜的轉錄因子網(wǎng)絡相互作用進而調控肝臟、腎及胰島β細胞的相關基因表達。新近研究表明HNF-1α可與C型反應性蛋白（C-reactive protein，CRP）的啟動子區(qū)結合進而調控其表達。CRP蛋白主要在肝臟中表達，

5、在多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展進程中產(chǎn)生關鍵作用。有研究顯示，在營養(yǎng)缺失的情況下，SIRT1通過脫去HNF-1α結合位點近端組蛋白H4賴氨酸16位點的乙?；M而抑制HNF-1α介導的CRP啟動子轉錄活化。碳水化合物反應元件結合蛋白（Carbohydrate response element-binding protein，ChREBP）主要參與糖酵解和脂生成相關基因的轉錄活化，在 ALD的疾病進程中發(fā)揮重要的作用。肝臟SIRT1特異性敲除的小

6、鼠 ChREBP蛋白表達明顯上調，伴隨嚴重的肝脂肪變。此外，本實驗室新近研究已證實多酚類雙萜化合物鼠尾草酸（Carnosic acid，CA）可通過激活 SIRT1/ChREBP信號通路減輕大鼠慢性酒精性脂肪肝病。綜上所述，我們提出以下假說：1）SIRT1是慢性酒精性肝損傷的重要調控分子，長期慢性酒精攝入所致SIRT1的表達變化可直接或間接影響炎癥相關蛋白CRP及脂代謝相關蛋白ChREBP的表達，進而參與調控ALD的疾病進程；2）丹酚酸

7、B可通過靶向SIRT1發(fā)揮其抗慢性酒精性肝病的保護作用。
　　AMP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成的異源三聚體）是機體能量代謝的主要調控子，可增加NAD+的水平。SIRT1是NAD+依賴的蛋白去乙?；?，營養(yǎng)攝入受限或應激反應時NAD+水平升高可激活SIRT1進而參與調控能量代謝及應激反應。研究表明AMPK和SIRT1之間存在相互調控作用，在能量代謝及

8、應激反應的調控中相輔相承。因此，我們推測AMPK可能參與介導丹酚酸B對SIRT1蛋白表達的調控。
　　本課題將從以下三部分展開論述：
　　1)丹酚酸B對長期攝入酒精所致大鼠肝損傷的保護作用；
　　2) SalB通過SIRT1抑制CRP和ChREBP表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷；
　　3)SalB通過AMPKα1激活SIRT1緩解大鼠慢性酒精性肝損傷。
　　我們的研究結果顯示，丹酚酸 B對大鼠慢性酒精性肝損傷

9、具有顯著的保護作用，而肝臟SIRT1表達是其發(fā)揮保護作用的關鍵。丹酚酸B可以通過激活SIRT1進而抑制炎癥相關蛋白CRP及脂代謝相關蛋白ChREBP的表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷。本研究有助于為ALD的防治提供新的靶點，同時也為丹酚酸B的臨床應用及開發(fā)提供新的方向。
　　第一部分丹酚酸B對長期酒精攝入所致肝損傷的保護作用
　　目的：
　　探討SalB對慢性ALD的保護作用，明確SalB對長期酒精攝入的大鼠肝臟病理學和肝

10、臟功能、血清及肝組織中脂質堆積、炎癥因子以及對酒精誘導的HepG2細胞存活率的影響。
　　方法：
　　1.丹酚酸B對大鼠慢性酒精性肝損傷的保護作用研究。
　　將50只健康成年的雄性SD大鼠（180-220g）隨機分為以下5組：空白對照組；空白對照+SalB給藥組（30 mg/kg/d）；模型組；模型+低劑量SalB給藥組（15 mg/kg/d）；模型+高劑量SalB給藥組（30 mg/kg/d）。給藥方法為灌胃，酒精造

11、模參照Lieber-Decarli方案，酒精濃度前6周5%，最后兩周8%。8周后腹主動脈采集血液，分離大鼠肝臟組織標本。檢測血清中谷草轉氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）以及肝組織中總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、白介素6（Interleukin-6，IL-6）、腫

12、瘤壞死因子α（Tumor necrosisα，TNF-α）的活性。
　　2、丹酚酸B對酒精誘導HepG2細胞損傷的保護作用研究。
　　HepG2細胞隨機分成五組：空白對照組；EtoH組（EtoH濃度為100 mM）；低、中、高劑量丹酚酸B處理組（2μM、4μM、8μM）。在細胞中加入100 mM EtoH孵育48h造模，造模前、造模同時及造模后加入藥物進行處理，MTT實驗測定細胞存活率。
　　結果：
　　1.與空

13、白對照組相比，模型組肝組織病理學檢測結果顯示肝臟細胞腫脹變形且存在大泡型和小泡型相間的肝脂肪病變，肝小葉結構紊亂，肝臟炎性細胞浸潤明顯增加；血清 ALT、AST及肝組織 TG、TC、IL-6、TNF-α的水平顯著增加，表明肝組織存在中度或重度脂肪變，出現(xiàn)嚴重肝損傷和炎癥反應。與模型組相比，丹酚酸 B預處理組肝組織病理結果顯示肝臟脂質堆積及炎癥浸潤明顯得到改善；血清ALT、AST水平下降；肝組織TG、TC以及IL-1β、TNF-α水平顯著

14、降低，提示丹酚酸B可明顯減輕長期酒精攝入引起的大鼠肝組織損傷和炎癥反應。
　　2.在酒精導致的肝損傷體外模型中，分別在造模前、造模同時及造模后加入丹酚酸B，與模型組相比，三種方式的丹酚酸B處理組HepG2細胞存活率明顯提高，在中、高劑量組尤為明顯，且呈劑量依賴性。表明丹酚酸B對HepG2細胞酒精損傷具有保護作用。
　　結論：
　　丹酚酸B對長期酒精攝入引起的肝損傷具有顯著的保護作用。
　　第二部分 SalB通過S

15、IRT1抑制CRP和ChREBP表達減輕大鼠慢性酒精性肝損傷
　　目的：
　　探討SIRT1/CRP及SIRT1/ChREBP通路在慢性酒精性肝病中的作用，進一步闡明丹酚酸B對慢性酒精性肝病的保護作用機制。
　　方法：
　　1.丹酚酸B對大鼠慢性酒精性肝損傷SIRT1、CRP、HNF-1α、ChREBP蛋白和基因表達的影響。
　　按第一部分方法將正常SD大鼠分組，酒精造模8周結束后分離肝組織標本冷凍備用。采

16、用Western Blot法檢測肝組織中SIRT1、CRP、HNF-1α、ChREBP及β-actin的蛋白水平；采用qRT-PCR法檢測肝組織CRP及ChREBP的mRNA水平；
　　2.探討SIRT1/CRP和SIRT1/ChREBP通路在酒精誘導的HepG2細胞損傷中作用及丹酚酸B的保護作用機制。
　　實驗1.（1）HepG2細胞隨機分為4組：陰性對照組；陰性對照+SalB（8μM）組；轉染SIRT1 siRNA組；轉

17、染SIRT1 siRNA+SalB（8μM）組。轉染后，SalB給藥作用3h后提取細胞總蛋白。Western Blot法檢測細胞內SIRT1及CRP的蛋白表達情況。（2）HepG2細胞隨機分為五組：陰性對照組；陰性對照+EtoH組；陰性對照+EtoH+SalB（8μM）組；EtoH+轉染SIRT1 siRNA組；EtoH+轉染SIRT1 siRNA+SalB（8μM）組。轉染后，丹酚酸B給藥作用3h后，用EtoH（100 mM）誘導48

18、 h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內SIRT1及ChREBP的蛋白表達情況。
　　實驗2. HepG2細胞隨機分為5組：空白對照組；SalB（8μM）給藥組；EtoH組；EtoH+SalB（8μM）給藥組；EtoH+Ex527（10μM）預處理組。Ex527是SIRT1特異性的抑制劑。丹酚酸B或Ex527與細胞共同孵育3h或6h后，用濃度為100 mM的EtoH誘導48h造模。Western Blot法檢測細胞

19、內SIRT1、CRP的蛋白表達水平。尼羅紅染色法檢測細胞內脂質堆積的情況。
　　實驗3. HepG2細胞隨機分為4組：陰性對照組；陰性對照+SalB（8μM）組；轉染HNF-1αsiRNA組；轉染HNF-1αsiRNA+SalB（8μM）組。轉染后，SalB給藥作用6h后,用濃度為100 mM的EtoH誘導48h后提取細胞蛋白及RNA。Western Blot法檢測細胞內SIRT1、CRP及HNF-1α的蛋白表達情況。qRT-PC

20、R法檢測HepG2細胞HNF-1α的mRNA水平。
　　實驗4. HepG2細胞隨機分為4組：陰性對照組；陰性對照+RES（10μM）組；轉染HNF-1αsiRNA組；轉染HNF-1αsiRNA+RES（10μM）組。轉染后，RES給藥作用6h后,用終濃度為100 mM的EtoH誘導48h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內SIRT1、CRP及HNF-1α的蛋白表達情況。
　　結果：
　　1.體內實驗結

21、果顯示：與空白對照組相比，模型組大鼠肝組織SIRT1及HNF-1α表達降低，肝組織CRP及ChREBP蛋白表達及mRNA水平顯著升高。與模型組相比，丹酚酸B預處理后顯著上調SIRT1及HNF-1α的蛋白表達水平，同時CRP及ChREBP的蛋白及mRNA水平明顯降低。
　　2.體外實驗結果：
　　實驗1.（1）與陰性對照組相比，SalB可顯著上調SIRT1蛋白表達，抑制CRP蛋白表達；SIRT1基因被干擾后，CRP蛋白表達上調

22、，同時SalB對CRP蛋白表達的抑制作用減弱甚至消失，即SalB對CRP蛋白的調控可能是通過激活SIRT1實現(xiàn)的。（2）與陰性對照組相比，陰性對照+EtoH組SIRT1蛋白表達降低而ChREBP蛋白表達顯著升高；與陰性對照+EtoH組相比，SalB預處理可顯著上調SIRT1蛋白表達，同時抑制 ChREBP蛋白表達；SIRT1基因被干擾后，ChREBP蛋白表達上調，同時SalB對ChREBP的抑制作用減弱甚至消失，表明SalB對ChREB

23、P蛋白的調控作用與SIRT1有關。
　　實驗2.與EtoH組相比，SalB預處理可顯著上調SIRT1蛋白表達，同時抑制CRP蛋白表達，而采用Ex527特異性的阻斷SIRT1的蛋白表達后，CRP蛋白表達顯著上調，進一步證實SIRT1介導SalB對CRP蛋白表達的調控。
　　實驗3.與陰性對照組相比，SalB可顯著上調SIRT1及HNF-1α的蛋白表達，抑制CRP的蛋白表達；HNF-1α基因被干擾后，SalB對SIRT1的激活作

24、用不變，而對CRP的抑制作用明顯減弱甚至消失，即HNF-1α參與SalB對SIRT1調節(jié)的CRP表達抑制。
　　實驗4.與陰性對照組相比，SIRT1激活劑白藜蘆醇（Resveratrol，RES）上調HNF-1α蛋白表達，同時抑制CRP蛋白表達；HNF-1α基因被干擾后，RES對SIRT1的激活作用不變，而對 CRP蛋白表達的抑制作用明顯減弱甚至消失，即 SalB對SIRT1/CRP通路的調控主要是通過HNF-1α調節(jié)實現(xiàn)的。

25、r>　　結論：
　　1. SIRT1/CRP和SIRT1/ChREBP信號通路在大鼠慢性酒精性肝病中發(fā)揮重要的調控作用；
　　2.在酒精誘導的ALD中，SalB通過上調SIRT1抑制CRP和ChREBP的蛋白表達，從而發(fā)揮抗慢性酒精性肝病的保護作用。
　　第三部分 SalB通過AMPKα1激活SIRT1緩解大鼠慢性酒精性肝損傷
　　目的：
　　探討SalB通過調控AMPKα1激活SIRT1發(fā)揮肝保護作用的分

26、子機制。
　　方法：
　　1. SalB對AMPKα1蛋白磷酸化水平的影響。
　　正常SD大鼠酒精造模8周結束后分離肝組織標本冷凍備用。采用western-blot法檢測肝組織中AMPKα1、p-AMPKα1及β-actin的蛋白水平；
　　2.探究SalB激活SIRT1的相關分子機制。
　　采用RNA干擾等實驗，在體外細胞模型檢測丹酚酸 B對 AMPKα1及pAMPKα1蛋白表達水平的影響，進一步探討丹酚

27、酸B激活SIRT1的分子機制。1） HepG2細胞隨機分為四組：空白組；空白+SalB（8μM）組；EtoH組；EtoH+SalB（8μM）組。丹酚酸B給藥作用3h后，用EtoH（100 mM）誘導48 h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內AMPKα1、p-AMPKα1及β-actin的蛋白表達情況。2）HepG2細胞隨機分為四組：陰性對照組；陰性對照+SalB（8μM）組；轉染AMPKα1 siRNA組；轉染AMPK

28、α1 siRNA+SalB（8μM）組。轉染后，丹酚酸B給藥作用3h后提取細胞蛋白。Western Blot法檢測細胞內SIRT1、AMPKα1、p-AMPKα1及β-actin的蛋白表達情況。3）HepG2細胞隨機分為五組：陰性對照組；陰性對照+EtoH組；陰性對照+EtoH+SalB（8μM）組；EtoH+轉染AMPKα1 siRNA組；EtoH+轉染AMPKα1 siRNA+SalB（8μM）組。轉染后，丹酚酸B給藥作用3h后，用

29、EtoH（100 mM）誘導48 h造模，MTT實驗測定細胞存活率。
　　結果：
　　1.體內實驗結果顯示：慢性酒精性肝病大鼠肝組織中p-AMPKα1的蛋白表達水平明顯下調，而給予丹酚酸B預處理后可顯著逆轉p-AMPKα1蛋白表達下降，且呈一定的劑量依賴性。
　　2.體外實驗結果顯示：1）在HepG2細胞中，與空白組相比，丹酚酸B給藥組可上調 p-AMPKα1的蛋白表達，而與模型組相比，丹酚酸 B預處理亦可上調p-AM

30、PKα1的蛋白表達；2）HepG2細胞轉染AMPKα1 siRNA后，AMPKα1基因的表達被抑制。與陰性對照組相比，丹酚酸B預處理組可顯著上調p-AMPKα1、SIRT1的蛋白表達，干擾AMPKα1后，丹酚酸B對p-AMPKα1、SIRT1的上調作用明顯減弱甚至消失；3）在酒精誘導的肝損傷體外模型中，與陰性對照組相比，酒精誘導的HepG2細胞存活率明顯降低，給予丹酚酸B預處理后，HepG2細胞存活率明顯提高；當同時給予酒精誘導時，與空