LSP1基因多態(tài)性與膀胱癌的關(guān)聯(lián)分析及LSP1在膀胱癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、第一部分：LSP1基因多態(tài)性rs907611與膀胱癌的相關(guān)性分析
　　目的：研究白細(xì)胞特異性蛋白1（Leukocyte-specific protein1，LSP1）單核苷酸多態(tài)性 rs907611與天津地區(qū)漢族人群膀胱尿路上皮癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　方法：收集2012年5月至2014年6月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院初次確診的535例膀胱尿路上皮癌患者的血液及649例對(duì)照組人群（與病例組年齡、性別相匹配的正常體檢人群）的血液進(jìn)

2、行研究，提取全血基因組 DNA，應(yīng)用 PCR-LDR方法進(jìn)行基因分型。首先檢驗(yàn)分型結(jié)果是否遵循HWE平衡定律，然后采用多因素非條件 logistic回歸檢驗(yàn)來分析 rs907611基因型與天津漢族人群膀胱癌易感性、分期、分級(jí)、吸煙及進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-Meier曲線和COX回歸模型來分析rs907611基因型與膀胱癌短期復(fù)發(fā)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：分型結(jié)果符合HWE平衡定律（p>0.05）。LSP1 rs907611

3、存在三種基因型：野生型（G/G）、突變雜合子（G/A）及突變純合子（A/A）。以野生型（G/G）基因型為對(duì)照，突變純合子（ A/A）人群膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯提高（ p=0.036， OR=1.786，95％CI1.038-3.072），突變型（G/A+A/A）人群中膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也有輕微升高（p=0.049，OR=1.264，95%CI1.001-1.596）；與G等位基因相比， A等位基因與膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在明顯的相關(guān)性（p=0.0

4、19，OR=1.264，95%CI1.038-1.538）。分層分析結(jié)果顯示rs907611與膀胱癌分期分級(jí)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有明顯的相關(guān)性。另外，結(jié)果顯示rs907611對(duì)吸煙人群膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有影響。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，沒有發(fā)現(xiàn)這 rs907611與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的短期復(fù)發(fā)存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：LSP1基因rs907611位點(diǎn)基因突變可顯著增加天津地區(qū)漢族人群膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，尤其與低級(jí)別、非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的發(fā)生關(guān)系密

5、切。這一基因并不會(huì)影響吸煙患者膀胱癌的發(fā)病率，也與天津地區(qū)漢族人群膀胱癌的短期復(fù)發(fā)沒有顯著地相關(guān)性。
　　第二部分：膀胱癌易感位點(diǎn)LSP1 rs907611的功能分析
　　目的：通過研究rs907611多態(tài)性位點(diǎn)周圍基因的表達(dá)量與rs907611基因型的相關(guān)性來篩選單核苷酸多態(tài)性rs907611的靶基因，從而進(jìn)一步探討rs907611增加膀胱癌易感性的作用機(jī)制。
　　方法：在UCSC Genome Browser中檢索

6、rs907611位點(diǎn)兩側(cè)各250kbp范圍內(nèi)的基因（包括DNA、microRNA和lincRNA）。從我實(shí)驗(yàn)室膀胱癌標(biāo)本庫(kù)中隨機(jī)選擇與rs907611的三種基因型相對(duì)應(yīng)的患者的膀胱癌及癌旁組織標(biāo)本共24對(duì)，其中G/G基因型10對(duì)、G/A及A/A基因型各7對(duì)，提取組織RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量Q-PCR的方法檢測(cè)相應(yīng)基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：在 rs907611兩側(cè)500kbp范圍內(nèi)共存在21個(gè)基因，其中 DNA包括KRTAP5-3、K

7、RTAP5-4、KRTAP5-5、KRTAP5-6、IFITM10、SYT8、TNNI2、LSP1、CTSD、TNNT3、HOTS和MRPL23；microRNA包括MIR4298、MIR7847和MIR675；lincRNA包括MRPL23-AS1、FAM99A、FAM99B、H19、Linc01219及Linc01150。Q-PCR結(jié)果顯示以上所有基因的表達(dá)量與rs907611的基因型均沒有明顯的相關(guān)性（p>0.05）；但是我們發(fā)現(xiàn)

8、癌組織中LSP1及MIR7847的表達(dá)量明顯低于癌旁組織（p<0.05），癌組織中H19和MIR675的表達(dá)量明顯高于癌旁組織（p<0.05）。
　　結(jié)論：在LSP1基因多態(tài)性rs907611位點(diǎn)周圍500kbp范圍內(nèi)沒有rs907611的靶基因；LSP1及MIR7847在癌組織中明顯低表達(dá)，而H19和MIR675在膀胱癌組織中明顯高表達(dá)。
　　第三部分： LSP1在膀胱癌中的表達(dá)及意義
　　目的：研究LSP1在膀胱癌

9、中的表達(dá)水平，并初步探討LSP1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響。
　　方法：應(yīng)用免疫組化和 western-blot技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織及癌旁正常膀胱黏膜LSP1的表達(dá)情況。構(gòu)建LSP1過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染T24膀胱癌細(xì)胞，應(yīng)用Q-PCR、Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，應(yīng)用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LSP1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響。
　　結(jié)果：免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示L

10、SP1在膀胱癌組織中明顯低表達(dá)。我們成功構(gòu)建 pcDNA3.1(+)/LSP1過表達(dá)質(zhì)粒并順利轉(zhuǎn)染 T24膀胱癌細(xì)胞；MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LSP1過表達(dá)質(zhì)粒后T24細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示出T24細(xì)胞中LSP1過表達(dá)后細(xì)胞凋亡明顯增加；劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LSP1過表達(dá)后，T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱。
　　結(jié)論：LSP1是一種抑癌基因，它在膀胱癌組織中明顯低表達(dá)，可以明顯抑制膀胱細(xì)胞的