XPC、XPA基因在膀胱癌中的表達(dá).pdf

1、背景和目的： 人類細(xì)胞中基因組DNA不斷受到內(nèi)源性和環(huán)境因素的損傷。內(nèi)源性因子如細(xì)胞代謝中間產(chǎn)物及毒素、環(huán)境因素包括紫外線、化學(xué)毒物等都可導(dǎo)致DNA損傷。DNA損傷后，首先通過(guò)對(duì)損傷的感知(sensors)和識(shí)別，經(jīng)過(guò)某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生以下效應(yīng)：DNA修復(fù)；旁路復(fù)制以及凋亡(apoptosis)。DNA修復(fù)是維持細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性和高保真性的重要機(jī)制。如果DNA修復(fù)發(fā)生改變，將導(dǎo)致?lián)p傷的DNA不能修復(fù)或不能J下確修復(fù)從而發(fā)生突變，突

2、變的的發(fā)生將最終導(dǎo)致許多遺傳性疾病的產(chǎn)生和癌癥的發(fā)生(carcinogenesis)。 根據(jù)DNA損傷的性質(zhì)，DNA修復(fù)途徑可分為：(1)堿基切除修復(fù)；(2)核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair，NER)；(3)錯(cuò)配修復(fù)；(4)重組修復(fù)。在眾多的DNA修復(fù)途徑和機(jī)制中，NER是主要的修復(fù)途徑，能夠修復(fù)大量的：DNA損傷，所以NER在維持基因組穩(wěn)定性和高保真性方面發(fā)揮著重要作用。 NER有兩個(gè)分

3、途徑：即基因組修復(fù)(GlobalGenomeRepairGGR)和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)(Transcription-Coupled.Repair，TCR)。GGR參與基因組任何序列損傷的修復(fù)，對(duì)于阻止癌癥的發(fā)生具有重要作用。TCR修復(fù)具有轉(zhuǎn)錄活性基因轉(zhuǎn)錄鏈上的DNA損傷，其主要作用是延緩衰老過(guò)程。這兩個(gè)NER分途徑都有四個(gè)步驟：(1)損傷識(shí)別和剪切復(fù)合體的聚集；(2)螺旋雙鏈解旋；(3)損傷切除；(4)DNA修復(fù)合成以及雙鏈連接；其中DNA損傷

4、識(shí)別最為重要，只有損傷的DNA被識(shí)別后，后續(xù)修復(fù)過(guò)程才能啟動(dòng)。XPC(xerodermapigmentosumgenegroupC，XPC)蛋白與hHR23B結(jié)合，在GGR過(guò)程中發(fā)揮著識(shí)別作用；而XPA(xerodermapigmentosumgenegroupA，XPA)在GGR和TCR途徑的交叉位點(diǎn)發(fā)揮作用，沒(méi)有XPA的參與，GGR和TCR都不能夠發(fā)生。 XPC最初從著色性干皮病(xerodermapigmentosum，X

5、P)發(fā)現(xiàn)的，作為一種常染色體隱性遺傳病，著色性干皮病的最主要特征是患者皮膚對(duì)陽(yáng)光敏感并可在幼年發(fā)展為瘍。隨后幾乎90％的病人會(huì)在十多歲發(fā)生基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤等皮膚癌。在紫外線作用下，XP患者罹患皮膚癌的機(jī)率顯著高于正常，約為正常人的2000倍。cleaver等首先發(fā)現(xiàn)該病是由于患者對(duì)紫外線照射造成的核苷酸損傷切除修復(fù)缺陷所致。隨著研究的深入，到目前已有7組互補(bǔ)型及一種XP變異型被發(fā)現(xiàn)，與之相對(duì)應(yīng)的基因分別被命名為XPA、X

6、PB、XPC、XPD、XPE、XPF、XPG和XPV。 XPC基因由15個(gè)外顯子組成，約17kb大小，定位于3p25。XPC蛋白存在于細(xì)胞核中，有證據(jù)顯示，XPC蛋白可與hHR23B基因的表達(dá)產(chǎn)物緊密結(jié)合形成一個(gè)異二聚體，在GGR途徑中起著DNA識(shí)別的作用。有研究表明，XPC在肺癌中低表達(dá)，并且低表達(dá)的XPC與肺癌的發(fā)生具有一定的聯(lián)系。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，XPC在膀胱癌細(xì)胞株HT1197中低表達(dá)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，xpc-/-小鼠

7、中，膀胱癌的發(fā)生率升高。然而，對(duì)于XPC在膀胱癌組織中的表達(dá)，目前尚不明確。 XPA在NER過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用，xpa-/-小鼠體內(nèi)沒(méi)有NER機(jī)制。XPA基因含六個(gè)外顯子，不同的外顯子編碼不同的氨基酸結(jié)構(gòu)。其中E1編碼與RPA34結(jié)合結(jié)構(gòu)，E2編碼與ERCCl結(jié)合結(jié)構(gòu)，E3編碼鋅指結(jié)構(gòu)，E4和E5編碼loop-richsubdomain，與DNA結(jié)合，E6編碼TEIIH結(jié)構(gòu)。其中任何一個(gè)結(jié)構(gòu)變異，都將導(dǎo)致NER機(jī)制效率降

8、低甚至不能發(fā)生。UV照射xpa-/-小鼠后發(fā)現(xiàn)，其各種癌癥(包括膀胱癌)發(fā)生率比正常小鼠明顯升高。由此可以推測(cè)，XPA基因的表達(dá)狀況，在膀胱癌發(fā)生方面，具有一定的影響。 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)高發(fā)性腫瘤，其中膀胱移行細(xì)胞癌占90％。膀胱癌的致病因素主要有：吸煙，工業(yè)相關(guān)的胺類以及人體攝入的某些藥物。由于膀胱為空去腔型器官，膀胱粘膜長(zhǎng)期暴露于尿液當(dāng)中，尿液中的各種物質(zhì)不斷的造成DNA損傷，因此DNA修復(fù)對(duì)于膀胱癌來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。由于NER

9、機(jī)制能夠修復(fù)大量的DNA損傷，對(duì)于保持細(xì)胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要作用因此，研究NER.機(jī)制在膀胱癌中作用，可能為膀胱癌的防治提供新的線索。 鑒于XPC、XPA在NER機(jī)制中的重要作用，本課題采用了Real-timePCR法比較膀胱癌組織與正常膀胱組織中XPC，XPA基因在RNA水平表達(dá)的差異性。Real-timePCR是一種高效敏感的mRNA檢測(cè)方法，其準(zhǔn)確性和特異性比以往的Northern等檢測(cè)mRNA的方法有很大的提高。為

10、檢測(cè)XPC、XPA蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)，本課題還采用WesternBlot比較膀胱癌組織與正常膀胱組織中XPC、XPA在蛋白水平的差異。此外，本課題中還用順鉑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株BIU-87，5637,Real-timePCR檢測(cè)分析順鉑處理前后膀胱癌細(xì)胞株中XPC、XPA的表達(dá)，對(duì)XPC、XPA與膀胱癌耐藥性之間的關(guān)系，做了初步研究。 方法： XPC、XPA在膀胱癌組織中的表達(dá)。取西南醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除標(biāo)本(27例膀

11、胱癌)，液氮冰凍保存。提取膀胱癌組織和正常組織中RNA，Real-timePCR法比較XPC、XPA的表達(dá)；提取組織中總蛋白，Western:Blot檢測(cè)XPC、XPA蛋白表達(dá)。 膀胱癌耐藥性與NER基因XPC、XPA的關(guān)系。培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞株BIU-87，5367，用化療藥物順鉑刺激細(xì)胞株之后，提取細(xì)胞中RNA，檢測(cè)XPC、XPA的表達(dá)，與未用順鉑處理的BIU87，5367細(xì)胞株中XPC、XPA表達(dá)作比較。 結(jié)果：

12、 成功提取膀胱癌組織中RNA，并建立Real-time定量PCR反應(yīng)條件體系：在采用real-time定量PCR法檢測(cè)基因表達(dá)之前，首先要建立定量PCR的反應(yīng)條件，使反應(yīng)的擴(kuò)增效率在90～110％之間，同時(shí)所設(shè)計(jì)的real-timePCR引物必需具有擴(kuò)增特異性。 采用Real-timePCR檢測(cè)了膀胱癌與膀胱組織中XPC、XPA的表達(dá)差異，膀胱癌中XPC、XPA表達(dá)明顯低于正常膀胱組織(P＜0.01)。此外，結(jié)合臨床資料，我們

13、發(fā)現(xiàn)化療病人的膀胱癌組織中XPC、XPA的表達(dá)比沒(méi)有經(jīng)過(guò)化療的膀胱癌組織中XPC、XPA的表達(dá)高(P＜0.05)。 成功提取了組織中的總蛋白，并采用western檢測(cè)了膀胱癌組織以及膀胱組織中XPC、XPA蛋白表達(dá)，最終發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中XPC、XPA蛋白的表達(dá)比正常膀胱組織中低(P＜0.01)。 成功培養(yǎng)BIU87、5637膀胱癌細(xì)胞株，并用化療藥物順鉑處理了其中一批細(xì)胞，之后，提取細(xì)胞中的RNA，比較藥物處理前后XPC、

14、XPA的表達(dá)差異性，最終發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導(dǎo)后，膀胱癌細(xì)胞株BIU-87，5637的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。 結(jié)論： 膀胱癌組織中XPC、XPA的在RNA水平的表達(dá)比正常膀胱組織中低，并且低表達(dá)的XPC、XPA基因與膀胱癌的發(fā)生具有一定的關(guān)系。 化療病人的膀胱癌組織中，XPC、XPA在RNA水平的表達(dá)升高，以及膀胱癌細(xì)胞株BIu-87和5637在經(jīng)過(guò)順鉑誘導(dǎo)后，XPC、XPA的表達(dá)升高，這一結(jié)果初步說(shuō)明了XPC、