熱休克蛋白27(Hsp27)在舌癌化療耐藥中的作用及機制.pdf

1、目的：
　　舌癌是最常見的口腔惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率居高不下，當前舌癌的治療手段仍然是手術輔以放療或化療的綜合治療，平陽霉素（P YM）和/或順鉑（cDDP）為主的化療在舌癌的綜合治療中起重要作用，但化療耐藥一直是舌癌成功治療的瓶頸問題。為了探討舌癌細胞化療耐藥機制,本課題組前期通過低濃度遞增結合大劑量反復誘導舌癌 Tca8113細胞建立了舌癌多藥耐藥細胞系（Tca8113/PYM），本研究擬利用該耐藥模型，在差異蛋白質組學方

2、法建立耐藥差異蛋白質譜的基礎上篩選鑒定新的耐藥分子,為闡釋舌癌耐藥機制提供進一步證據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用蛋白質雙向電泳（2-DE）結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和 ESI-Q-TOF-MS串聯(lián)質譜分析構建舌癌化療耐藥相關蛋白表達譜；
　?。?）采用脂質體轉染方法導入 Hsp27基因或靶向 Hsp27的 shRNA，采用western blot分別檢測各組細胞 Hsp27的蛋白

3、表達水平；ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液中 Hsp27蛋白含量；分別用人 Hsp27重組蛋白（rhHsp27）和Hsp27中和抗體處理敏感細胞和耐藥細胞后；M TS法檢測各組細胞對PYM和cDDP的化療敏感性；
　　（3）將 Hsp27過表達細胞 Tca8113/pLEX-Hsp27和其對照細胞 Tca8113/p LEX-con細胞建立裸鼠移植瘤模型，體內觀察 Hsp27過表達對舌癌細胞化療敏感性的影響；
　?。?）分別用w

4、estern blot和ELISA檢測在化療條件下各舌癌細胞系中和細胞培養(yǎng)液中 Hsp27的蛋白水平，ELISA檢測正常健康人和有/無經過 P YM和/或cDDP化療舌癌患者血清中Hsp27的蛋白水平；
　?。?）通過NF-κB活性的報告基因實驗和western blot檢測Hsp27表達干預、rhHsp27或 Hsp27中和抗體處理細胞中 NF-κB信號通路活性；通過轉染sh-RN A干擾舌癌細胞 TLR5后，觀察 rhHsp2

5、7對 NF-κB信號通路活性的影響，用免疫共沉淀實驗觀察細胞外Hsp27與TLR5的結合情況；
　　（6）用Caspase3活性報告實驗結合western blot檢測Caspase3剪切情況以觀察Caspase3活化情況，用 western blot檢測線粒體和細胞質中凋亡相關蛋白水平；用免疫共沉淀實驗觀察Hsp27與BAX、BAD及BIM等促凋亡蛋白的結合情況。
　?。?）收集具備完整臨床資料的舌癌標本，通過免疫組化法檢

6、測舌癌組織中Hsp27及其他相關基因的蛋白水平，分析 Hsp27蛋白水平與舌癌患者預后的相關性。
　　結果：
　?。?）經過進一步誘導，目前舌癌耐藥細胞Tca8113/P YM對P YM的耐藥指數(shù)為15.37，對cDDP的耐藥指數(shù)為6.82，并且呈現(xiàn)出明顯的凋亡抗性；
　?。?）差異蛋白質組方法發(fā)現(xiàn)18個舌癌耐藥相關蛋白，其中表達上調蛋白12個，下調蛋白6個，部分差異蛋白驗證結果與上述結果差異趨勢一致；
　　（3

7、）耐藥細胞 Tca8113/PYM中和其培養(yǎng)上清中 Hsp27蛋白水平明顯高于正?？谇徽衬ぜ毎?Hacat和 Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27等化療相對較敏感的舌癌細胞，化療藥物能上調舌癌細胞和細胞培養(yǎng)液中Hsp27蛋白水平，舌癌患者血清中 Hsp27蛋白水平高于正常健康人血清，化療能上調舌癌患者血清中Hsp27蛋白水平；
　?。?）過表達 Hsp27或用 rhHsp27處理能增加舌癌細胞對 P

8、YM和 cDDP的耐受性，干擾沉默 Tca8113/PYM中 Hsp27表達或用 Hsp27中和抗體處理能逆轉舌癌耐藥細胞的化療耐受性；裸鼠體內實驗表明過表達 Hsp27能增加Tca8113細胞對PYM和cDDP的化療耐受性；
　?。?）Tca8113/PYM細胞中NF-κB信號活性高于其他舌癌細胞，而IκBα蛋白水平低于其他細胞，在 Tca8113/P YM細胞中，干擾 Hsp27表達或用 Hsp27中和抗體處理能下調 NF-κ

9、B信號活性、p65核移和 p-IκBα水平，上調IκBα水平；在 Tca8113和SCC-25細胞中，過表達Hsp27或用 rhHsp27處理能上調NF-κB信號活性、p65核移位和p-IκBα水平，下調IκBα水平；在舌癌組織中 Hsp27高表達與 p65核移位呈正相關、與 IκBα蛋白水平呈負相關；通過轉染 IκBα顯性負突變載體 pBabe-IκBα或用 NF-κB抑制劑BAY11-7082抑制劑處理能逆轉 rhHsp27處理誘導

10、的 NF-κB信號活性升高；
　?。?）舌癌細胞和組織中呈現(xiàn)較高的 TLR5表達豐度，在 Tca8113/PYM細胞中，干擾TLR5表達能下調NF-κB信號活性、p65核移和p-IκBα水平，上調 IκBα水平；在 Tca8113和 SCC-25細胞中，干擾下調 TLR5表達能逆轉 rhHsp27誘導的 NF-κB信號活性、p65核移和 p-IκBα水平升高， IκBα水平下調；免疫共沉淀結果顯示細胞外rhHsp27能與TLR5相

11、互作用。
　　（7）干擾下調 Hsp27表達和過表達 Hsp27對舌癌細胞化療敏感性和 Caspase3活化的影響強于 Hsp27中和抗體和 rhHsp27處理；Hsp27表達干預并不能明顯影響化療誘導BAX、BAD和 BIM表達；但在Tca8113和SCC-25細胞中，過表達Hsp27能抑制化療誘導的BAX和BIM向線粒體移位、以及線粒體 Cytochrome C向細胞質的釋放；在 Tca8113/P YM細胞中，干擾Hsp27

12、表達則能促進化療誘導的 BAX和 BIM向線粒體移位、以及線粒體Cytochrome C向細胞質的釋放；免疫共沉淀結果顯示 Hsp27能與 BAX和BIM結合。
　?。?）化療能誘導舌癌組織促凋亡分子 BAX、BAD和 BIM表達，舌癌組織中Hsp27高表達與 p65核移位呈正相關，而與 IκBα蛋白水平和 Caspase3活化呈負相關；Hsp27高表達與舌癌患者預后呈負相關。
　　結論：
　?。?）構建了舌癌耐藥相關

13、蛋白表達譜；
　　（2） PYM/CDDP化療能誘導舌癌細胞和舌癌患者血清中 Hsp27表達上調， Hsp27作為舌癌耐藥的相關因子，能介導舌癌PYM/CDDP化療耐藥；
　?。?）Hsp27在細胞外通過與 TLR5相互作用而下調 IκBα功能，從而活化舌癌細胞中NF-κB信號以介導化療耐藥；
　?。?）Hsp27在細胞內通過與促凋亡分子 BAX和 BIM結合抑制其向線粒體移位，從而抑制化療誘導的線粒體凋亡信號通路；<