熱休克蛋白27心肌保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、一、背景：熱休克蛋白27(heatshockprotein27，Hsp27)，屬于小分子熱休克蛋白家族，在成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和神經(jīng)元等非肌源性細(xì)胞中，已被證實具有抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。在離體心臟中，業(yè)已初步發(fā)現(xiàn)Hsp27可提高心肌細(xì)胞對高溫應(yīng)激(即熱休克)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的耐受性，但其作用機(jī)制尚不清楚；不僅如此，Hsp27在整體動物心肌中的生物學(xué)作用，更有待闡明。 二、目的：分別在細(xì)胞水平和整體水平，探討Hsp27

2、在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和化學(xué)藥物誘導(dǎo)的心肌毒性中的生物學(xué)功能，并對其制進(jìn)行初步探討。 三、方法：[體外研究]克隆和重組人心肌Hsp27基因，并觀察其高表達(dá)對大鼠心肌細(xì)胞株H9c2過氧化損傷的影響及其機(jī)制 1.將RT-PCR獲得的人心肌Hsp27基因全長cDNA，重組入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，再瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞株進(jìn)行真核表達(dá)活性鑒定，進(jìn)而轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞株H9c2，再經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)，最后獲得穩(wěn)定

3、轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)Hsp27基因的H9c2細(xì)胞株。 2.以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hsp27的H9c2(Hsp27H9c2)和空載體轉(zhuǎn)染的H9c2(CON)為實驗對象，不同濃度H2O2刺激后，進(jìn)行下列分析：①倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；②測定乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)從胞質(zhì)向胞外釋放的活性；③細(xì)胞凋亡水平；④胞內(nèi)總活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，-3-ROS)水平；⑤線粒體內(nèi)膜跨膜

4、電位(△ψm)；⑥Akt/PKB信號通路活性的變化。[體內(nèi)研究]建立Hsp27心肌特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠模型，探討Hsp27心肌高表達(dá)對doxorubicin(Dox)誘導(dǎo)的充血性心力衰竭(congestiveheartfailure，CHF)的影響及其機(jī)制1、構(gòu)建含有心肌特異性表達(dá)啟動子重組質(zhì)粒pBSⅡ-SK+/Hsp27，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切和超級純化獲得用于顯微注射的轉(zhuǎn)移基因，繼而顯微注射、胚胎移植，獲得轉(zhuǎn)基因鼠(TG)。 2

5、、對同窩、同性別8周齡鼠，腹腔單劑量注射doxorubicin(25mg/kg)，誘導(dǎo)CHF，記錄小鼠死亡數(shù)量，并于第5天測定左心室血流動力學(xué)；另一獨立的、平行進(jìn)行的實驗組，于第3天分離心臟，用于組織學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)分析。 四、結(jié)果：[體外研究]Hsp27高表達(dá)顯著減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷性變化。同時可見，H2O2誘導(dǎo)的LDH釋放、細(xì)胞凋亡、胞內(nèi)ROS水平和△ψm丟失均被高表達(dá)的Hsp27顯著減輕(P＜0

6、.05或0.01)，Hsp27高表達(dá)也顯著增強(qiáng)了H2O2誘導(dǎo)的Akt磷酸化激活(P＜0.01)。 [體內(nèi)研究]經(jīng)基因型鑒定，成功獲得3個轉(zhuǎn)基因鼠line，均為心肌特異性高表達(dá)Hsp27。在Dox誘導(dǎo)的小鼠CHF模型中，Hsp27心肌特異性高表達(dá)顯著改善了小鼠5天累積死亡率(p＜0.001)，抑制心臟/脛骨長度比值下降(P＜0.001)，改善左心室血流動力學(xué)(P＜0.01或P＜0.05)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞超微機(jī)構(gòu)的異

7、常改變、特別是線粒體的改變，抑制氧化應(yīng)激、以及由氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)羰基化修飾(P＜0.01)。不僅如此，Hsp27高表達(dá)還改變了Dox注射后部分誘導(dǎo)型熱休克蛋白(inducibleheatshockproteins，iHsps)的表達(dá)模式(expressionprofile)。 五、結(jié)論我們的體外和體內(nèi)研究表明，人類Hsp27基因高表達(dá)可以顯著抑制H2O2和Dox誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，改善心臟功能。對其機(jī)制的初步研究顯示，調(diào)節(jié)氧