熱休克蛋白27-70在雙環(huán)醇抗肝損傷保護(hù)機(jī)制中作用的研究.pdf

1、慢性病毒性肝炎特別是乙型和丙型肝炎的治療是當(dāng)今世界面臨的一個(gè)難題。我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，HBsAg攜帶者占我國(guó)總?cè)丝诘?-10％，同時(shí)由于乙肝可以通過母嬰垂直傳播，影響下一代，故危害極大。因病毒性肝炎發(fā)展隱匿，且目前尚缺乏有效的治療手段，造成大量的慢性肝病患者長(zhǎng)期遷延不愈，其中部分病人經(jīng)過5-20年會(huì)發(fā)展為肝纖維化，部分患者最終出現(xiàn)肝硬化或者肝癌，嚴(yán)重威脅病人的生命。肝臟有解毒和清除毒物的功能，同時(shí)也是毒物經(jīng)常攻擊的器官，在解剖上接

2、受肝動(dòng)脈和門靜脈雙重血液供應(yīng)?；瘜W(xué)物質(zhì)可通過胃腸道門靜脈或體循環(huán)進(jìn)入肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因此肝臟容易受到化學(xué)物中的毒性物質(zhì)損害。肝細(xì)胞損傷是各種肝病共同的病理基礎(chǔ)，其長(zhǎng)期存在往往是導(dǎo)致肝纖維化，甚至是肝硬化、肝癌的重要始動(dòng)因素。因此治療肝細(xì)胞損傷是臨床肝病治療的主要環(huán)節(jié)之一。已知多種致病因素可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，如肝炎病毒、酒精和藥物中毒等。肝損傷是一種由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜的生物學(xué)過程，損傷的結(jié)果是肝細(xì)胞可能發(fā)生凋亡或壞死。通過建立實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型

3、，研究肝臟發(fā)病機(jī)制，篩選保肝藥物，探索保肝作用機(jī)理，具有重要的臨床意義。 熱休克蛋白(HSPs)是進(jìn)化中高度保守的蛋白家族，其成員在細(xì)胞中有組成性和誘導(dǎo)性兩種表達(dá)方式。HSPs能幫助維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞在惡劣環(huán)境下的生存能力，是細(xì)胞防御機(jī)制的重要組成部分。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)許多應(yīng)激因子都能引起HSPs瞬時(shí)高表達(dá)來保護(hù)由應(yīng)激引起的損傷。HSPs的細(xì)胞保護(hù)作用主要是由于能與損傷的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助其重新折疊成天然構(gòu)象。當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)性或

4、物理性刺激導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，HSPs能夠阻止變性蛋白質(zhì)疏水區(qū)的聚集而提高變性蛋白質(zhì)的溶解性。雙環(huán)醇(4，4'-Dimethoxy-5，6，5'，6'-bis(methylene-dioxy)-2-hydroxymethy1-2'-methoxycarbonyl bipheny1)是我所自主研發(fā)的抗肝炎新藥，作為一種新型的抗肝炎藥物于2004年批準(zhǔn)用于臨床治療慢性病毒性肝炎。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)雙環(huán)醇的肝臟保護(hù)作用進(jìn)行了大量而充分的研究。先后采用五種

5、不同的實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型研究研究了雙環(huán)醇的保肝作用，結(jié)果表明雙環(huán)醇對(duì)CCl4、D-氨基半乳糖(D-GaIN)、撲熱息痛(APAP)、卡介苗加脂多糖和刀豆蛋白A(ConA)引起的小鼠肝損傷均有保護(hù)作用。其作用機(jī)制包括清除自由基、抑制肝細(xì)胞凋亡、保護(hù)線粒體、促進(jìn)肝臟解毒等。臨床應(yīng)用雙環(huán)醇能降低慢性乙肝病人血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平，并兼有一定的抗乙型肝炎病毒的作用，乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)陰率為20％。但是雙環(huán)醇的肝臟保護(hù)

6、機(jī)制還未完全闡明。內(nèi)源性HSPs可幫助維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞惡劣環(huán)境下的生存能力，有細(xì)胞保護(hù)作用?；谝陨侠碚?，我們?cè)O(shè)想雙環(huán)醇的肝臟保護(hù)作用是否通過誘導(dǎo)HSPs而實(shí)現(xiàn)的。為了證實(shí)這個(gè)設(shè)想，我們將從以下三部分進(jìn)行研究： 1.雙環(huán)醇對(duì)小鼠肝臟HSP27/70的誘導(dǎo)作用及對(duì)撲熱息痛誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)旨在研究抗肝炎新藥雙環(huán)醇對(duì)小鼠肝臟HSPs表達(dá)的影響及其在肝損傷中的保護(hù)作用。昆明種小鼠在24 h內(nèi)連續(xù)灌胃雙環(huán)醇200 mg

7、/kg三次，末次給藥后不同時(shí)間點(diǎn)取肝臟測(cè)定HSPs，發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇可時(shí)間依賴性的提高HSP27和HSP70的表達(dá)。另外，雙環(huán)醇100，200和300 mg/kg在24h內(nèi)灌胃小鼠三次，同時(shí)給予槲皮素200 mg/kg，末次給藥后6 h取肝臟檢測(cè)HSP27和HSP70的表達(dá)，結(jié)果顯示，雙環(huán)醇劑量依賴性的在蛋白和mRNA水平提高HSP27和HSP70的表達(dá)，而槲皮素能抑制雙環(huán)醇對(duì)HSP27/70的誘導(dǎo)作用。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇

8、能提高熱休克因子-1(HSFI)的磷酸化和入核。凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙環(huán)醇能提高HSF1與熱休克元件(HSE)的結(jié)合活性。在APAP造成的小鼠肝損傷模型中研究了雙環(huán)醇誘導(dǎo)HSPs與其保肝作用的關(guān)系。小鼠在24 h內(nèi)灌胃雙環(huán)醇300 mg/kg三次，同時(shí)給予槲皮素200 mg/kg，末次給藥后4 h腹腔注射APAP 200 mg/kg，6 h后取肝臟和血清做各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇誘導(dǎo)的HSP27和HSP70對(duì)APAP引起的小鼠血清

9、ALT/AST的升高、肝細(xì)胞凋亡和壞死以及線粒體的損傷均有保護(hù)作用。以上結(jié)果表明雙環(huán)醇能誘導(dǎo)小鼠肝臟HSP27和HSP70高表達(dá)，該作用是通過激活HSF1實(shí)現(xiàn)的，雙環(huán)醇的肝臟保護(hù)作用與其誘導(dǎo)HSPs高表達(dá)有關(guān)。本結(jié)果為解釋雙環(huán)醇抗肝損傷作用提供了新的理論依據(jù)。 2.雙環(huán)醇對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用與其誘導(dǎo)HSP27/70的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)主要研究雙環(huán)醇誘導(dǎo)的HSPs能否減輕由ConA引起的肝損傷及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，雙環(huán)醇可時(shí)

10、間(200mg/kg)和劑量(100，200，300mg/kg)依賴性的誘導(dǎo)注射ConA小鼠肝臟HSP27和HSP70的表達(dá)，雙環(huán)醇對(duì)HSP27和HSP70的誘導(dǎo)作用是通過激活HSF1實(shí)現(xiàn)的。雙環(huán)醇(300mg/kg)可以減輕由ConA引起的小鼠肝損傷，表現(xiàn)為降低小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT/AST的水平，改善肝細(xì)胞凋亡和壞死以及線粒體損傷導(dǎo)致的cytochrome c和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的外漏。雙環(huán)醇的肝臟保護(hù)作用與HSP27和HSP70

11、高表達(dá)一致，HSPs合成抑制劑槲皮素能減弱雙環(huán)醇的作用。雙環(huán)醇誘導(dǎo)的HSP27和HSP70可抑制ConA引起的NF-κB通路的激活，表現(xiàn)為HSP70與IκB相互作用抑制IκB的降解，HSP27與IKK相互作用抑制IKK的激活，進(jìn)而抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位以及與核內(nèi)DNA的結(jié)合活性。HSP27和HSP70還可抑制由ConA引起的JNK和p38的活化。以上結(jié)果表明，雙環(huán)醇可通過誘導(dǎo)小鼠肝臟HSP2/70而實(shí)現(xiàn)抗ConA所致肝損傷的作用

12、，其保肝作用主要是通過HSP27/70抑制NF-κB和MAPK通路實(shí)現(xiàn)的。 3．RNAi技術(shù)研究環(huán)醇誘導(dǎo)的熱休克蛋白抗D-氨基半乳糖引起的HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制上述研究證明雙環(huán)醇具有HSPs誘導(dǎo)作用，并且與其保肝作用密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用RNAi技術(shù)進(jìn)一步闡明雙環(huán)醇誘導(dǎo)HSP27/70的作用與其抗肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)用D-GaIN誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡及相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的變化觀察雙環(huán)醇的作用。結(jié)果顯示雙環(huán)醇(50μM)能時(shí)間依

13、賴性的誘導(dǎo)HSP27/70的表達(dá)。雙環(huán)醇(25，50和100μM)劑量依賴性的在蛋白和mRNA水平誘導(dǎo)HSP2/70的表達(dá)和激活HSF1。MTT結(jié)果顯示D-GaIN時(shí)間和劑量依賴性的降低HepG2細(xì)胞的存活率。應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色也顯示細(xì)胞出現(xiàn)了典型的G-1亞峰，Hoechst33258染色顯示細(xì)胞核固縮濃染，或呈碎塊狀、顆粒狀致密濃染，即出現(xiàn)了比較典型的凋亡細(xì)胞特征。采用RNAi抑制HSP70表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇誘導(dǎo)的HSP70在D-G

14、aIN誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。此外，雙環(huán)醇誘導(dǎo)的HSP27和HSP70可抑制D-GaIN引起的HepG2細(xì)胞caspase-3的活化，NF-κB p65核轉(zhuǎn)位及DNA結(jié)合活性，IKK的磷酸化以及IκB的降解。HSP70可以抑制JNK的磷酸化，而HSP27對(duì)JNK的磷酸化抑制作用不明顯。免疫共沉淀結(jié)果顯示，HSP27與cytochrome c相互作用，HSP70與Apafl和AIF相互作用，從而抑制D-GaIN引起的HepG2

15、細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明雙環(huán)醇對(duì)肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，主要是通過誘導(dǎo)HSP27和HSP70實(shí)現(xiàn)的。HSP27和HSP70主要通過抑制NF-κB和JNK凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與凋亡通路中重要的蛋白質(zhì)如cytochrome c、Apaf1和AIF結(jié)合，抑制caspase-3的活化，在肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。 結(jié)論：1.雙環(huán)醇可激活HSPs合成的重要轉(zhuǎn)錄因子HSF1，啟動(dòng)熱休克基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)小鼠肝臟HSP27和HSP70的高表達(dá)