結(jié)蛋白病肌纖維內(nèi)線粒體膜孔通道蛋白1相關(guān)蛋白表達(dá)異常的觀察.pdf

1、背景與目的：
　　結(jié)蛋白基因突變導(dǎo)致的結(jié)蛋白病是一種遺傳性蛋白聚集性肌病，線粒體異常是結(jié)蛋白病最早發(fā)生的病理改變之一，然而導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)異常的相關(guān)機(jī)制目前不完全清楚。膜孔通道蛋白1/電壓依賴(lài)陰離子通道1（VDAC1）是線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔（mPTP）的重要調(diào)控亞基，當(dāng)mPTP通透性增高時(shí)，大量細(xì)胞凋亡因子從線粒體膜間隙釋放到胞漿，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而結(jié)蛋白病與VDAC1是否有明確關(guān)系尚無(wú)研究明確闡述，本研究通過(guò)免疫組化觀察結(jié)蛋

2、白沉積性肌病患者和結(jié)蛋白病動(dòng)物模型中VDAC1及其相關(guān)凋亡蛋白（Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）的表達(dá)，探究結(jié)蛋白病肌細(xì)胞內(nèi)線粒體異常的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建腺病毒包裝的突變型和野生型結(jié)蛋白基因的真核生物表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.首次造模：實(shí)驗(yàn)組將濃度為1.0×1011pfu/ml包裝有突變型結(jié)蛋白質(zhì)粒的腺病毒按九宮格法分九點(diǎn)微量注射到28-35日齡雄性SD大鼠左后大腿肌內(nèi)，每只大鼠注射總量

3、為100μl。右后大腿對(duì)應(yīng)點(diǎn)注射等量包裝有野生型結(jié)蛋白基因質(zhì)粒的腺病毒為對(duì)照組。分別于轉(zhuǎn)染后第2、7、14、21、28天各處死2只大鼠，取注射點(diǎn)處的肌肉行肌肉冰凍切片常規(guī)染色及desmin免疫組化染色。對(duì)比觀察出現(xiàn)以結(jié)蛋白沉積為主要改變的典型結(jié)蛋白病病理改變的轉(zhuǎn)染后天數(shù)，以確定造模條件。
　　3.重復(fù)造模：根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將突變結(jié)蛋白基因的腺病毒微量注射4只28-35日齡雄性SD大鼠（方法同上），在已觀察到的出現(xiàn)以結(jié)蛋白沉積為

4、主要改變的轉(zhuǎn)染后天數(shù)取注射區(qū)局部肌肉，行冰凍切片desmin免疫組化染色，觀察模型的穩(wěn)定性。
　　4.將造模成功動(dòng)物模型與結(jié)蛋白沉積性肌病患者骨骼肌行常規(guī)病理及免疫熒光雙標(biāo)染色，對(duì)比觀察VDAC1及其相關(guān)凋亡蛋白（Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.首次造模發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后第14天，2只SD大鼠實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染局部肌肉的肌纖維內(nèi)均出現(xiàn)結(jié)蛋白沉積等典型結(jié)蛋白病病理改變；取4只SD大鼠重

5、復(fù)造模，在轉(zhuǎn)染后第14天觀察到有3只大鼠實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染局部肌肉的肌纖維內(nèi)出現(xiàn)結(jié)蛋白沉積等典型結(jié)蛋白病病理改變。
　　2.結(jié)蛋白沉積性肌病患者與結(jié)蛋白病動(dòng)物模型均在結(jié)蛋白沉積的肌纖維內(nèi)出現(xiàn)VDAC1、促凋亡蛋白（Bax、ATF2）聚集高信號(hào)，而抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）無(wú)聚集。其中結(jié)蛋白沉積性肌病患者的結(jié)蛋白沉積肌纖維內(nèi)Bcl-2、Bcl-xl較正常肌纖維信號(hào)無(wú)明顯變化，HKⅡ較正常信號(hào)略低；結(jié)蛋白病動(dòng)物模型的結(jié)蛋白

6、沉積肌纖維內(nèi)Bcl-2較正常信號(hào)略低，Bcl-xl、HKⅡ較正常肌纖維信號(hào)無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.我們以腺病毒包被突變結(jié)蛋白基因以直接肌肉注射轉(zhuǎn)染方式成功構(gòu)建出結(jié)蛋白病動(dòng)物模型，驗(yàn)證模型穩(wěn)定性高。
　　2.結(jié)蛋白病的發(fā)生可能與線粒體相關(guān)性促凋亡蛋白（Bax、ATF2）的活化，抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ）的表達(dá)，刺激VDAC1開(kāi)放、高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡因子從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞