線粒體相關蛋白調控突觸核蛋白病理學作用研究.pdf

1、PINK1是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸激酶，保護細胞壓力應激所導致的線粒體功能障礙，調控神經元分化。突變的PINK1(PARK6)導致常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森病(PD)。β-synuclein(β-syn)是α-syn同系物，其錯義突變β-syn P123H被發(fā)現(xiàn)存在于家族性路易體癡呆患者。突變蛋白β-syn P123H在細胞內形成嗜酸性包涵體，并且與LAMP-2，ATP13A2，cathepsin等溶酶體標志物共存，在胞漿聚集誘導細

2、胞凋亡，具有加速神經退化的毒性作用。PINK1能夠維持線粒體內穩(wěn)態(tài)，在PD病理學變化過程起著關鍵作用，但是 PINK1通過線粒體保護作用介導突觸核蛋白病理學過程的機制還不清楚。本課題將在穩(wěn)定表達Parkin的HeLa細胞及穩(wěn)定表達β-syn P123H的B103神經母細胞瘤細胞進行，研究PINK1/Parkin通過調控線粒體自噬，促進β-syn P123H自噬降解的神經保護作用及其分子機制。
　　本文采用PCR構建PINK1野生型

3、(PINK1 WT)及兩步PCR法定點突變技術構建PINK1 Q126P、E240K、G309D、L347P、P498L突變真核表達載體，測序驗證后應用免疫印跡技術(Western Blot)鑒定其在細胞內表達情況。WST-1細胞活性檢測及LDH細胞毒性實驗分析PINK1 WT及突變體對細胞存活的影響。結果顯示，轉染PINK1突變體的細胞存活率下降，細胞毒性增加。相比對照組，轉染野生型 PINK1質粒的細胞無顯著性差異。應用細胞免疫熒光

4、化學染色的方法，觀察PINK1 WT及其突變體細胞定位情況，以及Parkin突變體T240R、R275W的細胞分布形態(tài)。運用線粒體TMRE熒光標記技術，以FCCP組作為陽性對照，分析Parkin突變體T240R、R275W對線粒體膜電位的影響。通過脂質體轉染及Western Blot方法，分析PINK1、Parkin對線粒體分裂融合動態(tài)變化的影響。免疫熒光細胞化學結果顯示：PINK1突變后線粒體異常聚集。Parkin突變體在胞漿形成聚集

5、體，并且導致線粒體膜電位降低。免疫印跡分析結果顯示：PINK1、Parkin的突變則導致了線粒體分裂、融合功能降低。野生型PINK1、Parkin參與線粒體質量控制，促進β-synP123H自噬降解。免疫熒光細胞化學實驗證明β-synP123H及ParkinT240R聚集體經自噬溶酶體途徑降解，ParkinT240R則加重了β-synP123H聚集體的形成。通過自噬誘導劑Rapamycin，抑制劑3-MA、NH4Cl作用，結合TUNEL

6、細胞凋亡檢測方法，研究自噬在β-synP123H、ParkinT240R所誘導的細胞凋亡過程的作用。對TUNEL陽性細胞進行計數(shù)，統(tǒng)計分析結果顯示：相對于DMSO組，3-MA、NH4Cl組細胞死亡數(shù)目明顯增多，而Rapamycin組細胞死亡數(shù)目減少。總之，突變PINK1誘導線粒體斷裂形成聚集體，并且導致細胞活性下降，細胞毒性增加。Parkin突變體在細胞內形成聚集體，導致線粒體膜電位降低。Parkin突變聚集體和β-synP123H經自