水稻白葉枯病菌蛋白PXO03968相關(guān)蛋白酶的分析.pdf

1、水稻白葉枯病菌是一種能夠引起水稻細(xì)菌性災(zāi)害的革蘭氏陰性細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，白葉枯病菌PXO_03968編碼蛋白質(zhì)在成熟的過程中需要蛋白酶的酶切作用，其產(chǎn)物17肽在白葉枯病菌中高度保守。為尋找PXO_03968編碼蛋白質(zhì)成熟相關(guān)蛋白酶，我們主要進(jìn)行一下幾個(gè)部分的工作:基于FRET現(xiàn)象構(gòu)建蛋白酶檢測器;白葉枯病菌(PXO99)胞外蛋白酶初步分離分析;預(yù)測蛋白酶的克隆表達(dá)及純化。
　　蛋白酶，又稱為蛋白水解酶。蛋白酶參與了生物體的多種代謝過

2、程:調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的定位與活性、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、參與胞內(nèi)信分子信號(hào)傳導(dǎo)，以及新生物活性分子的生成等。對(duì)于蛋白酶活性的生化分析方法可分為兩類:均相檢測和分離型檢測。在均相檢測中無需進(jìn)行進(jìn)一步的分離即可在反應(yīng)混合液中檢測到底物或者產(chǎn)物信號(hào)的變化;在分離型檢測中，停止酶反應(yīng)后的反應(yīng)混合物中產(chǎn)物以及殘余底物需要經(jīng)進(jìn)一步的分離來檢測分析酶活。均相檢測中主要是應(yīng)用熒光標(biāo)記技術(shù)檢測蛋白酶活性。目前廣泛應(yīng)用的四種方法為:以酰胺鍵連接的多肽和熒光

3、基團(tuán)為底物;以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的一對(duì)熒光蛋白為底物;以發(fā)生熒光淬滅的一對(duì)熒光蛋白為底物;檢測酶切前后的熒光偏振強(qiáng)度。分離型檢測反應(yīng)中，底物與產(chǎn)物通過合適方法進(jìn)行分離，然后進(jìn)行檢測和定量。
　　根據(jù)已知的PXO_03968編碼序列，利用PCR方法將PXO_03968構(gòu)建到CFP和YFP蛋白之間，在大腸桿菌中超表達(dá)并純化此融合蛋白，所得目的蛋白為包涵體，復(fù)性困難。且在目的蛋白中并沒有預(yù)期的FRET現(xiàn)象，可能是由于CFP和YFP蛋白

4、之間的距離超出FRET所需的極限距離。根據(jù)預(yù)測的酶切位點(diǎn)序列，將預(yù)測酶切位點(diǎn)（EGDYVRTP/TDGRDADG）構(gòu)建到CFP和YFP蛋白，最終獲得目的蛋白質(zhì)具有明顯的FRET現(xiàn)象，以此蛋白作為蛋白酶檢測器。并利用pMal-c2e載體克隆表達(dá)可溶性PXO_03968蛋白。
　　通過超濾等濃縮方法處理PXO99細(xì)菌培養(yǎng)液，獲得粗分離的蛋白酶混合物。通過蛋白酶檢測器的檢測，發(fā)現(xiàn)大于30KDa的組分能夠使蛋白酶檢測器的FRET現(xiàn)象消失。

5、表明在大于30KDa的蛋白質(zhì)混合物中存在一種或者幾種能夠在特定位點(diǎn)對(duì)EGDYVRTP/TDGRDADG進(jìn)行切割的蛋白酶。
　　將大于30KDa的組分經(jīng)過質(zhì)譜分析，所得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，給出390種可能蛋白質(zhì)。分析其中的蛋白酶，發(fā)現(xiàn)蛋白酶YP_001914183.1;YP_001914215.1; YP_001916133.1;YP_001911256.1;YP_001911714.1?？寺〔⒃吮磉_(dá)這些蛋白質(zhì)，最終只獲得可溶的蛋白