轉錄因子DEAF1相關功能蛋白的篩選.pdf

1、目的:獲得轉錄因子DEAF1穩(wěn)定高表達的293T細胞株,通過免疫共沉淀(Co-IP)和質譜分析技術篩選能與DEAF1相互作用的蛋白質因子,以闡明 DEAF1在淋巴結中調控外周組織抗原基因表達的分子機制及外周免疫耐受建立、維持的機制,為1型糖尿病早期干預和治療提供新策略。
　　方法:(1)用TurboFect轉染試劑將質粒pEGFP-mDEAF1和pEGFP-N1分別轉染293T和2F-2B細胞株,經(jīng)24小時后,通過熒光顯微鏡觀察D

2、EAF1在2種細胞中的定位。(2)用TurboFect轉染試劑將質粒p3×FLAG-mDEAF1分別轉染293T和2F-2B細胞株,同時設置相應未轉染的空白對照組,經(jīng)24小時后,通過RT-PCR法和Real-time PCR法檢測DEAF1在2種細胞中mRNA表達水平,通過Western blot法檢測DEAF1在2種細胞中蛋白表達水平。(3)用TurboFect轉染試劑將p3×FLAG-mDEAF1質粒轉染293T細胞,經(jīng)48小時后,

3、用1000μg/ml的G418篩選陽性克隆,挑取單個陽性克隆擴大培養(yǎng),用Western blot、免疫熒光和FCM檢測鑒定DEAF1穩(wěn)定表達的293T細胞株(293T-DEAF1)。(4)抽提293T-DEAF1和正常293T細胞的核蛋白,用EZviewTM Red ANTI-FLAG M2親和珠子進行Co-IP,SDS-PAGE分離,挑選明顯富集和對照泳道沒有的條帶做質譜分析,明確DEAF1的相關功能蛋白。
　　結果:(1)熒光

4、顯微鏡下可見DEAF1定位于細胞核。(2) RT-PCR、Real-time PCR檢測轉染組DEAF1的mRNA表達水平明顯高于未轉染組,分別為P<0.05和P<0.01,差異具有統(tǒng)計學意義;Western blot法檢測轉染組有融合蛋白mDEAF1/FLAG表達。(3)成功獲得穩(wěn)定高表達DEAF1的293T細胞株。(4)經(jīng)Co-IP篩選和質譜分析得到一些DEAF1的相關功能蛋白。
　　結論:成功獲得穩(wěn)定高表達DEAF1的293