PGAM1在腎透明細胞癌中的表達、臨床意義及其功能研究.pdf

1、目的：
　　1、探討PGAM1在腎透明細胞癌及癌旁相對正常腎組織中的表達及其臨床意義。
　　2、探討PGAM1在在腎透明細胞癌組織中的表達與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　3、探討PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞生物學(xué)功能的影響及其作用機制。
　　方法：
　　1、收集192例腎透明細胞癌組織及80例腎癌遠端正常腎組織中，經(jīng)固定、脫水制成石蠟組織塊，采用免疫組化檢測PGAM1的表達，并分析PGAM1在腎透明細胞癌組

2、織中的表達與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。
　　2、采用qRT-PCR定量檢測了3對腎透明細胞癌及配對遠端正常腎組織中PGAM1mRNA的表達，同時，通過Western blot定量檢測了8對腎透明細胞癌及配對正常腎組織中PGAM1蛋白的表達情況，進一步明確PGAM1在腎癌及癌旁腎組織中的表達。
　　3、采用qRT-PCR檢測了PGAM1在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中的表達。同時，行siRNA干擾片段瞬時

3、轉(zhuǎn)染，敲低PGAM1在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中的表達，并行qRT-PCR及Western blot進行驗證。
　　4、采用流式細胞儀檢測PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中凋亡的影響;同時，采用MTT實驗檢測PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2增殖的影響。
　　5、通過qRT-PCR及Western blot檢測腎透明細胞癌細胞株RLC-3

4、10及Caki-2中PGAM1表達下調(diào)后，P53、Caspase3及Caspase9的表達情況，初步探討PGAM1發(fā)揮生物學(xué)功能的機制。
　　結(jié)果：
　　1.PGAM1在腎透明細胞癌中的表達
　　首先，我們通過免疫組化檢測了192例腎透明細胞癌組織及80例腎癌遠端正常腎組織中PGAM1的表達，結(jié)果表明PGAM1陽性表達主要定位于細胞質(zhì)，在正常腎組織及腎透明細胞癌組織中均可見陽性表達。
　　隨后，我們采用qRT-P

5、CR定量檢測了三對腎透明細胞癌及配對遠端正常腎組織中PGAM1mRNA的表達，結(jié)果表明PGAM1在腎透明細胞癌中的表達約為正常腎組織中表達的4.2倍，明顯高于正常腎組織，統(tǒng)計學(xué)分析表明差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1-2，P=0.004）。
　　同時，我們也探討PGMA1在腎透明細胞癌表達與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示:PGMA1表達與年齡、腫瘤大小及T分期相關(guān)，而與性別、腫瘤位置及吸煙史無明顯相關(guān)。其中，92例年齡＞57歲患者中1

6、2例患者PGMA1呈高表達，其高表達率明顯低于≤57歲患者(43/100)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。58例腫瘤直徑≥5 cm患者中，34例患者呈高表達，其高表達率明顯高于腫瘤直徑＜5 cm的腫瘤患者(54/134)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0027)。80例T2-T3患者中，46例呈PGAM1高表達，其高表達率明顯高于T1期患者，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。
　　2.腎透明細胞癌中PGAM1表達與

7、患者預(yù)后的關(guān)系
　　依據(jù)腎細胞癌患者的預(yù)后相關(guān)資料，我們采用Kaplan-Meier法探討了臨床病理特征與腎透明細胞癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明腎透明細胞癌患者的預(yù)后與PGAM1表達、腫瘤大小及T分期密切相關(guān)。其中，PGAM1高表達患者的平均生存時間為48月，明顯低于PGAM1低表達患者的平均生存時間（56月），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。同時，結(jié)果顯示腫瘤直徑＜5 cm患者的術(shù)后平均生存時間為55月，明顯高于腫瘤直徑≥5

8、 cm的患者（47月），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。T1患者的平均生存時間為55月，明顯高于T2-T3期患者（49月），差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。然而，年齡、性別、腫瘤位置及吸煙史與患者的預(yù)后無明顯相關(guān)（P＞0.05）。
　　隨后，我們探討了PGAM1表達與臨床病理特征的關(guān)系對患者預(yù)后的影響。我們發(fā)現(xiàn)在年齡≤57歲的患者中，PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者（P=0.000）;而在年齡＞57歲的

9、患者中，PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.203)。在男性患者中，PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者（P=0.000）;同樣，在女性患者中，PGAM1高表達患者預(yù)后明顯較差(P=0.013)。在左側(cè)腎透明細胞癌中，PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者（P=0.000）;而在右側(cè)腎透明細胞癌中，PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.579);在有吸煙史及無吸煙史患者中，PGAM1高表達患者預(yù)后均明顯差于低表達患者(P

10、=0.000，P=0.006)。在腫瘤小于5cm的腎透明細胞癌患者中，PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者(P=0.000);而在腫瘤≥5cm腎透明細胞癌中，PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)(P=0.47);在T1期腎透明細胞癌患者中，PGAM1高表達患者預(yù)后明顯差于低表達患者（P=0.000）;而在T2-T3期腎透明細胞癌患者中，PGAM1表達與預(yù)后無明顯相關(guān)（P=0.945）。多因素回歸分析PGAM1及腫瘤大小可作為腎透明細胞癌

11、患者預(yù)后評估的獨立因素，而T分期并不能作為腎透明細胞癌患者預(yù)后評估的獨立因素。
　　3.敲低PGAM1表達對腎透明細胞癌細胞生物學(xué)功能的影響
　　我們首先通過qRT-PCR檢測了PGAM1在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中的表達，發(fā)現(xiàn)在腎透明細胞癌細胞株RLC-310及Caki-2中均能檢測到PGAM1的表達，其中RLC-310中的表達高于Caki-2。隨后，我們通過siRNA干擾技術(shù)將PGAM1干擾片段瞬時

12、轉(zhuǎn)染了兩株細胞，并采用qRT-PCR及Westernblot進行了相應(yīng)的驗證。qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后，PGAM1在RLC-310及Caki-2細胞中的表達均明顯下調(diào)，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001，P=0.008），表明RLC-310及Caki-2中PGAM1表達被成功敲低，PGAM1干擾片段成功轉(zhuǎn)染。
　　隨后，通過MTT實驗探討了PGM1表達下調(diào)對透明細胞癌細胞增殖能力的影響。結(jié)

13、果表明在RLC-310細胞中，PGAM1表達下調(diào)后細胞增殖時檢測到的OD值與對照組相比明顯降低（P=0.000），生長曲線較平緩。同樣，在Caki-2細胞中，PGAM1表達下調(diào)后細胞增殖時檢測到的OD值與對照組相比明顯降低（P=0.000），生長曲線較平緩，表明PGAM1表達下調(diào)后Caki-2細胞增殖能力減弱。同時，采用流式細胞儀檢測了PGAM1表達下調(diào)對腎透明細胞癌細胞凋亡的影響。結(jié)果表明:在RLC-310細胞中，PGAM1表達下調(diào)后

14、細胞的凋亡率為15.67％±0.52％，而對照組細胞的凋亡率為5.21％±1.04％，兩組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。在Caki-2細胞中，PGAM1表達下調(diào)后細胞的凋亡率為11.83％±1.09％，而對照組細胞的凋亡率為4.81％±1.33％，兩組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。
　　4.PGAM1表達下調(diào)發(fā)揮生物學(xué)功能相關(guān)機制的初步研究
　　首先，我們通過qRT-P

15、CR檢測了P53、Caspase3及Caspase9的在RLC-310腎透明癌細胞株中的表達，結(jié)果顯示PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase3及Caspase9表達均明顯上調(diào)，與對照組相比，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨后，我們也檢測了P53、Caspase3及Caspase9的在Caki-2腎透明癌細胞株中的表達，結(jié)果也顯示PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase3及Caspase9表達也均明顯上調(diào)，與對照組相比，

16、差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　隨后，為了進一步證實PGAM1表達下調(diào)對P53、Caspase3及Caspase9的影響，我們通過Western blot進行了相應(yīng)驗證。在RLC-310腎透明癌細胞株中的，結(jié)果顯示:與對照組相比，PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase3及Caspase9表達均上調(diào)。經(jīng)灰度值檢測分析，表明PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase3及Caspase9的OD值明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)意

17、義（P＜0.05），提示GAM1在RLC-31表達下調(diào)后上調(diào)了P53、Caspase3及Caspase9表達。同樣，在Caki-2腎透明癌細胞株中的，結(jié)果顯示:與對照組相比，PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase3及Caspase9表達均上調(diào)。經(jīng)灰度值檢測分析，表明PGAM1表達下調(diào)后P53、Caspase3及Caspase9的OD值明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示GAM1在Caki-2表達下調(diào)后上調(diào)了P53、Casp

18、ase3及Caspase9表達。
　　結(jié)論:
　　1.PGAM1在腎透明細胞癌組織中的表達明顯高于周圍正常腎組織，其在腎透明細胞癌組織中的表達與腎透明細胞癌的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。
　　2.PGAM1表達與腎透明細胞癌患者的臨床病理特征相關(guān)，并影響患者的預(yù)后相關(guān)，PGAM1可作為腎透明細胞癌預(yù)后評估的獨立因素。
　　3.PGAM1表達下調(diào)具有促進腎透明細胞癌細胞凋亡，抑制其增殖的生物學(xué)功能，其作用機制與P53/Casp