質體定位蛋白Pt-mVirD2的編碼基因合成與T-DNA型煙草質體轉化載體的構建.pdf

1、葉綠體轉化具有高豐量表達目的基因、以定點整合方式導入外源基因從而消除了位置效應及基因沉默、能按原核表達方式以多順反子的形式表達多個基因、母系遺傳方式可防止基因擴散、基因產(chǎn)物區(qū)域化并能提供適于某些產(chǎn)物發(fā)揮功能的小環(huán)境等優(yōu)點。其應用價值越來越受到人們的重視。現(xiàn)在絕大多數(shù)的植物質體轉基<都采用基因槍法，也有少數(shù)實驗采用PEG介導的原生質體法。此外，還有采用微注射法成功實現(xiàn)外源基因瞬時表達的報道。但是，這些方法均存在轉化效率低、同質化時間長和可

2、能同時將質體基因污染性整合進核基因組等問題，已成為該技術迅速發(fā)展與廣泛利用中迫切需要解決的難題。 本研究克隆了根癌農(nóng)桿菌的VirD2基因片段mVirD2和擬南芥AtCor15a基因的質體定位信號肽的編碼序列pt(plastid-targeted)，構成了編碼質體定位融合蛋白的核基因pt-mVirD2；同時，構建帶有T-DNA結構的煙草質體轉化載體：以期為下一步進行葉綠體定向轉化、解決當前質體轉化難度大和效率低等問題奠定基礎。主

3、要實驗結果如下： 1.構建了分別含有pt-mVirD2-GUS和pt-mVirD2-GFP基因的植物基因雙元表達載體 以根癌農(nóng)桿菌C58基因組、pMD-AtCor15a質粒為模板，分別擴增了喪失核定位信號的mVirD2基因片段和質體定位信號序列pt，構建了分別含有pt-mVirD2-GUS嵌合基因和pt-mVirD2-GFP嵌合基因的植物基因雙元表達載體pVCT2155和pVCT2210。 2.將pt-mV

4、irD2-GUS和p-mVirD2-GFP目的基因分別導入煙草基因組，獲得轉基因植株 (1)采用葉盤法經(jīng)農(nóng)桿菌介導在50mg/l潮霉素的篩選壓下篩選，得到潮霉素陽性植株。經(jīng)PCR擴增證實，目的基因pt-mVirD2-GUS整合進了煙草基因組。 (2)采用葉盤法經(jīng)農(nóng)桿菌介導在150mg/l卡那霉素的篩選壓下篩選，得到卡那霉素陽性植株，將目的基因pt-mVirD2/GFP導入煙草。對抗性植株進行顯微觀察能夠看到綠色熒光。