多基因雙T-DNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、20世紀(jì)80年代以來(lái)，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的植物基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用為植物的遺傳改良開(kāi)拓了廣闊的前景。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物絕大多數(shù)是通過(guò)單個(gè)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化而獲得的。長(zhǎng)期以來(lái)，培育具有多種優(yōu)良品質(zhì)，如高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗、多抗或具備其他生產(chǎn)上有用的特性的作物品種一直是科學(xué)家進(jìn)行植物遺傳改良的共同愿望。為此，多基因組裝與轉(zhuǎn)化技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生，以便將多個(gè)目的基因?qū)氲街参锘蚪M中并在植物中進(jìn)行表達(dá)。其策略之一即為構(gòu)建多基因植物表達(dá)載體。 在

2、大力發(fā)展農(nóng)業(yè)基因工程的同時(shí)，用以有效篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因，除草劑抗性基因等)的使用卻引發(fā)了人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性的隱憂(yōu)。因此，培育具有安全選擇標(biāo)記基因或無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物已成為基因工程亟待解決的問(wèn)題。其中雙T-DNA系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)篩選完成后選擇標(biāo)記基因刪除的一種簡(jiǎn)便可行的策略。 本研究以質(zhì)粒pCAMBIA1300為骨架，利用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)多基因雙T-DNA植物表達(dá)載體：2T-bbgdD。

3、該載體含有兩個(gè)T-DNA區(qū)：第一個(gè)T-DNA區(qū)含有CaMV35S啟動(dòng)予啟動(dòng)的抗性基因DREB1A、hsp熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子啟動(dòng)的抗性基因Na<'+>依賴(lài)性Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(簡(jiǎn)稱(chēng)為d5基因)和CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的報(bào)告基因gfp；第二個(gè)T-DNA區(qū)含有玉米泛素ubiquitin基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的抗性基因betA和花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S promoter)啟動(dòng)的抗除草劑基因bar。通過(guò)酶切鑒定，證明構(gòu)建的植物表達(dá)載體與預(yù)期設(shè)計(jì)

4、的一致。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該載體轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，通過(guò)對(duì)T<,1>代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，證明這兩個(gè)T-DNA區(qū)內(nèi)的五個(gè)基因(第一個(gè)T-DNA區(qū)內(nèi)的三個(gè)目的基因和第二個(gè)T-DNA區(qū)內(nèi)的兩個(gè)目的基因)及其各自的調(diào)控元件能共整合進(jìn)T<,1>代轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組中。對(duì)于不同的多基因共轉(zhuǎn)化的T<,1>代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，由于T-DNA區(qū)插入方式各異，因此在T<,2>代轉(zhuǎn)基因植株中，兩個(gè)T-DNA區(qū)既可能由于連鎖遺傳而共整合進(jìn)

5、同一轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)多基因的共轉(zhuǎn)化：也可能由于發(fā)生分離而分別整合進(jìn)不同的轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)選擇標(biāo)記基因與另一個(gè)T-DNA區(qū)所含的三個(gè)基因的分離。T<,2>代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該載體轉(zhuǎn)化擬南芥，既可獲得多基因共轉(zhuǎn)化的T<,2>代轉(zhuǎn)基因擬南芥純系，也可篩選到去除選擇標(biāo)記基因(bar基因)的T<,2>代轉(zhuǎn)基因擬南芥。通過(guò)模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，表明將本工作構(gòu)建的多基因雙T-DNA植物表