花生PEPCase基因反義表達載體構建與遺傳轉化高效基因型的篩選.pdf

1、花生是世界四大油料作物之一，也是我國單產、總產和出口創(chuàng)匯最高的油料作物。提高花生籽仁含油量是花生育種的重要目標之一。植物轉基因技術可根據育種目標有針對性地轉移單個或少數幾個基因，避免了大量不良基因的干擾，所需的群體小，周期短，比常規(guī)育種更有效。生物技術的發(fā)展，為利用基因工程提高花生含油量的育種工作奠定了基礎。反義RNA技術是利用人工合成的一段DNA(或cDNA)，反向與啟動子連接，將其導入受體細胞內轉錄成反義RNA，反義RNA與受體細胞

2、靶基因轉錄的RNA分子堿基互補，形成復合體，抑制目標基因的表達。植物油脂、蛋白質合成途徑中糖酵解產物-磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)可作為油脂、蛋白質生物合成的共同底物，PEPCase(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是油脂合成途徑中一個潛在關鍵調控點。利用反義RNA技術，抑制花生籽仁中PEPCase基因表達，降低PEPCase量，減少進入蛋白質合成途徑的PEP量，使更多PEP流向脂肪酸的合成途徑，為油脂合成提供更多底物，可有效提高花生籽仁含油量。

3、 本研究利用同源克隆技術獲得花生PEPCase基因的cDNA片段，將目的片段與花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)反向連接，構建反義表達載體；用含有質粒pGBVE(攜帶)γ-維生素E甲基轉移酶基因(γ，-tmt)和篩選標記基因bar)的根癌農桿菌GV3101侵染預培養(yǎng)4d的花生胚小葉，進行遺傳轉化，分析17個花生栽培品種(11個大花生品種和6個小花生品種)的植株再生率和基因轉化效率，篩選遺傳轉化率較高的品種。利用PCR技

4、術檢測抗PPT轉基因植株中目的基因的整合情況。主要研究結果如下： 1.花生PEPCase基因cDNA片段克隆及其反義表達載體構建 根據GenBank上發(fā)表的花生PEPCase基因序列(EU391629)設計引花生PEPCase基因反義表達載體構建與遺傳轉化高效基因型的篩選物，用荔蒲大花生cDNA為模板進行RT-PCR擴增PEPCase基因片段，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增的目的片段，并與克隆載體pGM-Teasy連接，獲

5、得重組質粒pGMPEP，序列分析表明，獲得的PEPCase基因序列長886bp，與GenBank發(fā)表的PEPCase基因序列的同源性為99.77％，氨基酸序列同源性100％。重組子pGMPEP和質粒pBI121分別用BamHI和SacI雙酶切，并回收PEPCase基因片段和切除GUS基因的pBI121載體DNA，反向目的基因片段與回收載體連接，構建成PEPCase基因的反義表達載體pBGPEP。 2.花生遺傳轉化高效基因型的篩選

6、 不同基因型之間的分化率、再生率和轉化率差異顯著。農桿菌侵染后分化率較高的品種有：豐花2號、05A110、花選9號、臨花5號和莒南2號，分化率分別是28.43％、18.40％、14.48、12.07％和10.52％；再生率較高的品種有：豐花2號、05A110、臨花5號、花選9號和莒南2號，再生率分別是67.57％、32.93％、24.77％、21.41％和21.21％。基因轉化率較高的品種是：莒南2號、臨花5號、HY-1和豐花2