葡萄糖陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因載體的合成和性能研究.pdf

1、在過(guò)去的三十年中，基因治療在治療人類疾病，如癌癥、病毒感染、艾滋病和心血管疾病等方面表現(xiàn)出了出巨大的潛能?；蛑委煹碾y點(diǎn)在于構(gòu)建低毒、高效和靶向的基因載體，目前基因載體的研究對(duì)象主要包括病毒載體和非病毒載體。非病毒載體相對(duì)于病毒載體而言具有較低細(xì)胞免疫反應(yīng)以及易制備、低成本和易檢驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)而引起廣泛重視。作為非病毒載體的之一的陽(yáng)離子脂質(zhì)體更是研究的熱點(diǎn)。
　　本論文合成了兩個(gè)系列的葡萄糖類陽(yáng)離子脂質(zhì)體。一類脂質(zhì)體疏水鏈與糖環(huán)相連，以

2、葡萄糖為原料，通過(guò)全乙酰化、脫1-O-乙?；?、施密特反應(yīng)、糖苷化、疊氮化、脫全部乙?；?、4，6-O-異丙叉基保護(hù)、威廉姆森醚化、脫叉基保護(hù)、還原氨化和季銨鹽化反應(yīng)，合成不同長(zhǎng)度疏水鏈的葡萄糖衍生物陽(yáng)離子脂質(zhì):di-C12-Glu-TMA、di-C14-Glu-TMA、di-C16-GluTMA和di-C18-Glu-TMA;另一類脂質(zhì)體疏水鏈與親水頭部相連，也是以葡萄糖為原料，通過(guò)全乙?；⒚?-O-乙?；?、三氯乙酰亞胺酯化、糖苷化、疊

3、氮化、脫全部乙?；⑦€原氨化、叔胺化和季銨鹽化反應(yīng)，合成不同長(zhǎng)度疏水鏈葡萄糖衍生物陽(yáng)離子脂質(zhì):Glu-DiC12MA、GluDiC14MA、Glu-DiC16MA和Glu-DiC18MA。
　　將脂質(zhì)體溶于水中，然后通過(guò)超聲波分散技術(shù)，形成脂質(zhì)體水溶液，再與pEGFP-C3的質(zhì)?；旌现瞥芍|(zhì)體/DNA復(fù)合物。各陽(yáng)離子脂質(zhì)體和脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的平均粒徑、粒徑分布以及Zeta電位都通過(guò)Zetasizer Nano ZS激光粒度儀來(lái)

4、測(cè)定。研究結(jié)果表明，單一陽(yáng)離脂質(zhì)體的平均粒徑在60-250nm之間，除了脂質(zhì)體Glu-DiC18MA;所有陽(yáng)離子脂質(zhì)體的Zeta電位在25-70mv之間;最佳N/P比（最佳轉(zhuǎn)染效果時(shí)的N/P比）時(shí)的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合的平均粒徑為90-180nm，其Zeta電位在在10-40mv之間。通過(guò)原子力顯微鏡對(duì)脂質(zhì)體及其DNA復(fù)合物的形態(tài)進(jìn)行表征，結(jié)果表明脂質(zhì)體及其DNA復(fù)合物呈微球形態(tài)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合質(zhì)粒DNA的能力通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)探究。實(shí)驗(yàn)

5、現(xiàn)象表明，DNA在凝膠中的滯留作用隨著脂質(zhì)體/DNA摩爾比（即N/P比）的增加而逐漸加強(qiáng)，當(dāng)N/P增加到3時(shí)，DNA與脂質(zhì)體結(jié)合完全。
　　以Lipo2000商用脂質(zhì)體作為陽(yáng)性對(duì)照，將糖類脂質(zhì)體與DNA復(fù)合后加入到HEK293細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)綠色熒光蛋白在細(xì)胞中表達(dá)狀況來(lái)判斷新型糖類脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果表明:與Lipo2000相比，脂質(zhì)體GluDiC14MA和Glu-DiC16MA具有很好的轉(zhuǎn)染效果，脂質(zhì)體di-C12-

6、Glu-TMA、di-C14-Glu-TMA和di-C16-GluTMA轉(zhuǎn)染效果較低。而脂質(zhì)體di-C18-Glu-TMA、Glu-DiC12MA和Glu-DiC18MA沒(méi)有轉(zhuǎn)染效果。說(shuō)明脂質(zhì)體疏水鏈與季銨鹽的氮相連比疏水鏈直接與糖以醚鍵相連的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果高。
　　以Lipo2000為陽(yáng)性對(duì)照，選擇在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率較高的陽(yáng)離子脂質(zhì)體GluDiC14MA和Glu-DiC16MA為研究對(duì)象，研究它們?cè)贖ela和HepG2