Lc基因新表達載體的構建及轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛的研究.pdf

1、花色是觀賞植物的重要性狀，改變花色以及創(chuàng)造新奇花色一直是花卉育種的主要目標之一。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，不斷成熟的基因工程技術為花卉改良開辟了一條全新的途徑，并已成為花卉育種的新趨勢。迄今為止，人們往往利用花色素苷合成過程中編碼關鍵性酶的結構基因來改變植物的花色，而應用調(diào)節(jié)基因改變植物花色的研究相對較少。早期研究表明，影響玉米色素合成的有myc和myb兩類轉(zhuǎn)錄因子，它們可能相互作用從而起到調(diào)節(jié)結構基因的作用。調(diào)節(jié)基因Lc也是一類與植物

2、花色形成密切相關的基因，前人的研究發(fā)現(xiàn)，將外源基因Lc導入煙草和擬南芥、矮牽牛突變體、蕃茄、雙色貝母等植物中，轉(zhuǎn)基因植株的花色素苷表達量明顯提高。 但目前在利用Lc調(diào)節(jié)基因改良花色研究中所用的表達載體均以卡那霉素抗性基因為選擇標記基因，這對于轉(zhuǎn)化卡那霉素不敏感或具有內(nèi)源卡那霉素抗性的植物存在局限性。所以我們以Lc為目的基因構建了新的表達載體，將pBI121質(zhì)粒中具有的Lc基因的35S啟動子、Lc基因及其終止子用限制性內(nèi)切酶切出，

3、然后將它們依次連接到pCAMBIA1301質(zhì)粒的多克隆位點中，構建成新的表達載體p1301-35S-Lc，從而賦予新表達載體潮霉素抗性基因和gus報告基因。以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因為抗性標記基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因植株篩選效果相對較好，可以彌補卡那霉素抗性基因的局限性；而gus報告基因有助于對轉(zhuǎn)基因植株進行早期檢測。本研究所構建的新表達載體p1301-35S-Lc，一方面可以擴大應用Lc基因進行轉(zhuǎn)基因研究的受體材料的范圍，另一方面又可以方便對轉(zhuǎn)基因

4、植株進行篩選和早期檢測。 本研究還利用根癌農(nóng)桿菌介導法將新構建的表達載體用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過對轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS染色進一步確認了p1301-35S-Lc新表達載體構建成功。保留GUS檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并將它們移入大田中栽培，花期觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入Lc基因的煙草花瓣顏色明顯加深，由淺粉紅色變?yōu)樯罴t色；花冠筒和中上段的花絲也表現(xiàn)出加深的紅色。前人已有報道，將2.2kb和2.4kb長的Lc基因分別轉(zhuǎn)化煙草

5、，結果也出現(xiàn)花色加深現(xiàn)象，而本研究中所用的Lc基因是只有1.8kb的cDNA，以上結果表明缺失5'端和3'端非轉(zhuǎn)譯區(qū)的Lc基因仍能實現(xiàn)其正常的調(diào)節(jié)功能，故也能改變植物的花色。 在成功轉(zhuǎn)化煙草的基礎上，我們又設計兩種不同激素組合的六種培養(yǎng)基探索白色、藍色、大紅色和紫紅色矮牽牛葉片的再生體系，并進一步在本實驗室建立起矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化體系。然后將p1301-35S-Lc新表達載體用葉盤法轉(zhuǎn)化矮牽牛，現(xiàn)已獲得了白花矮牽牛的轉(zhuǎn)基因植株，其