Lc基因新表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛的研究.pdf

1、花色是觀賞植物的重要性狀，改變花色以及創(chuàng)造新奇花色一直是花卉育種的主要目標(biāo)之一。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，不斷成熟的基因工程技術(shù)為花卉改良開辟了一條全新的途徑，并已成為花卉育種的新趨勢。迄今為止，人們往往利用花色素苷合成過程中編碼關(guān)鍵性酶的結(jié)構(gòu)基因來改變植物的花色，而應(yīng)用調(diào)節(jié)基因改變植物花色的研究相對較少。早期研究表明，影響玉米色素合成的有myc和myb兩類轉(zhuǎn)錄因子，它們可能相互作用從而起到調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的作用。調(diào)節(jié)基因Lc也是一類與植物

2、花色形成密切相關(guān)的基因，前人的研究發(fā)現(xiàn)，將外源基因Lc導(dǎo)入煙草和擬南芥、矮牽牛突變體、蕃茄、雙色貝母等植物中，轉(zhuǎn)基因植株的花色素苷表達(dá)量明顯提高。 但目前在利用Lc調(diào)節(jié)基因改良花色研究中所用的表達(dá)載體均以卡那霉素抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因，這對于轉(zhuǎn)化卡那霉素不敏感或具有內(nèi)源卡那霉素抗性的植物存在局限性。所以我們以Lc為目的基因構(gòu)建了新的表達(dá)載體，將pBI121質(zhì)粒中具有的Lc基因的35S啟動(dòng)子、Lc基因及其終止子用限制性內(nèi)切酶切出，

3、然后將它們依次連接到pCAMBIA1301質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成新的表達(dá)載體p1301-35S-Lc，從而賦予新表達(dá)載體潮霉素抗性基因和gus報(bào)告基因。以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因?yàn)榭剐詷?biāo)記基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因植株篩選效果相對較好，可以彌補(bǔ)卡那霉素抗性基因的局限性；而gus報(bào)告基因有助于對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行早期檢測。本研究所構(gòu)建的新表達(dá)載體p1301-35S-Lc，一方面可以擴(kuò)大應(yīng)用Lc基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究的受體材料的范圍，另一方面又可以方便對轉(zhuǎn)基因

4、植株進(jìn)行篩選和早期檢測。 本研究還利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將新構(gòu)建的表達(dá)載體用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過對轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS染色進(jìn)一步確認(rèn)了p1301-35S-Lc新表達(dá)載體構(gòu)建成功。保留GUS檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并將它們移入大田中栽培，花期觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入Lc基因的煙草花瓣顏色明顯加深，由淺粉紅色變?yōu)樯罴t色；花冠筒和中上段的花絲也表現(xiàn)出加深的紅色。前人已有報(bào)道，將2.2kb和2.4kb長的Lc基因分別轉(zhuǎn)化煙草

5、，結(jié)果也出現(xiàn)花色加深現(xiàn)象，而本研究中所用的Lc基因是只有1.8kb的cDNA，以上結(jié)果表明缺失5'端和3'端非轉(zhuǎn)譯區(qū)的Lc基因仍能實(shí)現(xiàn)其正常的調(diào)節(jié)功能，故也能改變植物的花色。 在成功轉(zhuǎn)化煙草的基礎(chǔ)上，我們又設(shè)計(jì)兩種不同激素組合的六種培養(yǎng)基探索白色、藍(lán)色、大紅色和紫紅色矮牽牛葉片的再生體系，并進(jìn)一步在本實(shí)驗(yàn)室建立起矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化體系。然后將p1301-35S-Lc新表達(dá)載體用葉盤法轉(zhuǎn)化矮牽牛，現(xiàn)已獲得了白花矮牽牛的轉(zhuǎn)基因植株，其