硫酸吲哚酚對(duì)單核細(xì)胞趨化功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、成人慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率逐年上升，多數(shù)國(guó)家超過(guò)10％，現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。隨著CKD病情進(jìn)展，部分患者將進(jìn)入終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)，體內(nèi)大量尿毒癥毒素蓄積，只能靠血液凈化或腎移植維持生命。ESRD患者體內(nèi)尿毒癥毒素蓄積，是導(dǎo)致尿毒癥狀況的根本原因。歐洲尿毒素研究組(European uremic toxin wor

2、k group，EUTox)根據(jù)這些毒素的分子量大小及蛋白結(jié)合特性將其分為小分子水溶性物質(zhì)(Free water-solublelow-molecular-weight solutes)(＜500Da)、蛋白結(jié)合毒素(Protein-bound uremictoxins，PBUTs)和中分子物質(zhì)(Middle molecules)(＞500Da)三類(lèi)。隨著透析技術(shù)的不斷改進(jìn)，分子量小于20kDa的化合物，即大部分的小分子水溶性毒素和中分

3、子毒素可被有效清除。然而，以硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate，IS)為代表的PBUTs，因常與血漿中的蛋白質(zhì)，尤其是與白蛋白(Human serum albumin，HSA)緊密結(jié)合而具有大分子物質(zhì)的特性，現(xiàn)有的透析手段難以將其清除。
　　心、腦血管事件是CKD患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，即便是進(jìn)入了維持性血液透析治療其發(fā)病率仍居高不下，成為導(dǎo)致透析患者死亡的主要原因。現(xiàn)有的透析技術(shù)不能清除PBUTs，提示PBUTs可能與CKD患

4、者心、腦血管事件的高發(fā)生率有著密切聯(lián)系。既往研究發(fā)現(xiàn)，PBUTs的典型代表IS可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖等，使受損的血管發(fā)生炎癥反應(yīng)，釋放單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)等炎癥細(xì)胞因子，MCP-1可與單核/巨噬細(xì)胞表面的CC類(lèi)趨化因子受體-2(C-C chemokine receptors2，CCR2)特異性結(jié)合，進(jìn)而激活并誘導(dǎo)外周血中單核/巨噬細(xì)胞向炎癥部位

5、遷移、黏附、浸潤(rùn)，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生?？梢?jiàn)單核/巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，而這一過(guò)程需要MCP-1等炎癥細(xì)胞因子及其受體的參與。既往關(guān)于PBUTs致動(dòng)脈硬化的相關(guān)研究中，多集中于PBUTs損傷血管產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活、誘導(dǎo)外周血中的單核/巨噬細(xì)胞向炎癥部位黏附和浸潤(rùn)。但PBUTs可否直接作用于單核/巨噬細(xì)胞，能否通過(guò)增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞的趨化、遷移功能而加速動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥相關(guān)并發(fā)癥的進(jìn)展，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道

6、，有待于進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　本研究以THP-1人單核細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察蛋白結(jié)合IS和游離IS對(duì)THP-1細(xì)胞趨化功能的影響及其可能機(jī)制，從而探討IS與CKD患者動(dòng)脈粥樣硬化及其他炎癥相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)系。
　　方法：
　　1.體外配制不同濃度的蛋白結(jié)合IS溶液(4％HSA+IS100μmol/L，4％HSA+IS200μmol/L,4％HSA+IS400μmol/L,4％HSA+IS800μ

7、mol/L)，用30K的Amicon Ultra-15離心過(guò)濾器超濾離心，以高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)超濾液中游離IS的含量，分別計(jì)算出IS的游離率和蛋白結(jié)合率。
　　2.體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，分別以不同濃度的蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS100μmol/L，4％HSA+IS200μmol/L,4％HSA+IS400μmol/L,4％HSA+IS8

8、00μmol/L)和游離IS(IS100，200，400，800μmol/L)處理12、24、48h后，以CCK-8法對(duì)各組單核細(xì)胞進(jìn)行增殖活性檢測(cè)。
　　3.按實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組（PBS平衡溶液），陰性對(duì)照組（4％HSA溶液），蛋白結(jié)合IS組(4％HSA+IS200μmol/L)，游離IS組(IS200μmol/L)處理THP-1細(xì)胞，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS200μmol/L)和游離IS

9、(IS200μmol/L)對(duì)THP-1細(xì)胞趨化功能的影響。
　　4.將體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞分別以蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS200μmol/L)和游離IS(IS200μmol/L)處理24h，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunoabsorbentassay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1的濃度。
　　5.將體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞分別以蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS200μmol/L)

10、和游離IS(IS200μmol/L)處理24h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞表面CCR2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.自制的不同濃度的蛋白結(jié)合IS溶液(4％HSA+IS100μmol/L，4％HSA+IS200μmol/L，4％HSA+IS400μmol/L，4％HSA+IS800μmol/L)中IS的游離率分別為:11.5％，12.8％，9.2％和7.85％，蛋白結(jié)合率分別為88.5％，87.2％，90.8％和92.15％

11、。
　　2.IS對(duì)單核細(xì)胞增殖抑制作用的影響:①游離IS對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖具有抑制作用，隨著游離IS的作用濃度增加，其對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有濃度依賴(lài)性（P＜0.05）;隨著游離IS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有時(shí)間依賴(lài)性(P＜0.05)。②蛋白結(jié)合IS對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖也具有抑制作用，隨著蛋白結(jié)合IS作用濃度的增加，其對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，大于200μ

12、mol/L的三個(gè)濃度組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)，隨著蛋白結(jié)合IS作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，但作用24h后各時(shí)間點(diǎn)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.按實(shí)驗(yàn)分組處理THP-1細(xì)胞24h后，趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:空白對(duì)照組(PBS平衡溶液)平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(13.2±5.6)個(gè)/視野;陰性對(duì)照組（4％HSA溶液）平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(14.5±6.4)個(gè)/視野;蛋白結(jié)合IS組（4％HSA+IS200μmol/L

13、溶液）平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(85.2±26.8)個(gè)/視野;游離IS組（IS200μmol/L溶液）平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(123.5±48.6)個(gè)/視野。與兩對(duì)照組相比，蛋白結(jié)合IS組和游離IS組趨化細(xì)胞數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;兩實(shí)驗(yàn)組間比較，游離IS組穿膜細(xì)胞數(shù)較蛋白結(jié)合IS組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.按實(shí)驗(yàn)分組處理THP-1細(xì)胞24h，與兩對(duì)照組比較，游離IS組(IS200μ

14、mol/L)和蛋白結(jié)合IS組(4％HSA+ IS200μmol/L) MCP-1濃度明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);兩實(shí)驗(yàn)組間比較，游離IS組MCP-1濃度高于蛋白結(jié)合IS組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.按實(shí)驗(yàn)分組處理THP-1細(xì)胞24h，與兩對(duì)照組比較，游離IS組CCR2表達(dá)率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與陰性對(duì)照組比較，蛋白結(jié)合IS組的CCR2表達(dá)均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

15、0.05);游離IS組與蛋白結(jié)合IS組之間比較，前者CCR2表達(dá)率明顯高于后者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　蛋白結(jié)合IS和游離IS均對(duì)單核細(xì)胞具有增殖抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性;蛋白結(jié)合IS同游離IS一樣，可上調(diào)MCP-1和CCR2的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)單核細(xì)胞的趨化功能;由于循環(huán)中蛋白結(jié)合的IS是游離IS的9倍，所以其對(duì)單核細(xì)胞趨化功能的影響更應(yīng)引起高度重視;設(shè)法解離與白蛋白結(jié)合的IS，增加IS的透析清除率，