縫隙連接蛋白43參與腦血管痙攣的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　縫隙連接(gap junction,GJ)是相鄰細(xì)胞間最直接快速的通訊方式,對(duì)維持血管細(xì)胞間的協(xié)同反應(yīng)起重要作用。在血管系統(tǒng)中共發(fā)現(xiàn)4種縫隙連接蛋白(connexion,Cx),包括Cx37、Cx40、Cx43和Cx45,其中Cx43最為重要, Cx43表達(dá)的紊亂,將會(huì)導(dǎo)致一系列的病理反應(yīng)及疾病。前期研究表明Cx43及其相關(guān)縫隙連接通道與腦血管痙攣(Cerebral vasospasm,CVS)關(guān)系密切,但機(jī)制尚不清楚

2、。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)Cx43參與CVS的機(jī)制進(jìn)行深入研究,以期通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探明Cx43參與CVS的相關(guān)分子機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.原代大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMCs)的培養(yǎng)和鑒定:分離SD-大鼠基底動(dòng)脈,利用組織貼塊法進(jìn)行平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng),采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　2.shRNA-Cx43腺病毒載體的構(gòu)建及感染效率的檢測(cè):構(gòu)建質(zhì)粒,利用293A細(xì)胞進(jìn)行包裝和滴度檢測(cè);用不同

3、稀釋度的病毒對(duì)平滑肌細(xì)胞進(jìn)行感染,綜合細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)以及熒光表達(dá)量來判斷具有最佳作用效果的病毒稀釋度,并以此稀釋度作為后續(xù)試驗(yàn)的依據(jù)。同時(shí),采用Western blot檢測(cè)病毒感染平滑肌細(xì)胞后Cx43表達(dá)水平的變化。
　　3.腦血管痙攣體外細(xì)胞模型的構(gòu)建及腦血管痙攣后細(xì)胞間收縮信號(hào)交流的改變:利用OxyHb刺激平滑肌細(xì)胞構(gòu)建腦血管痙攣雙層共培養(yǎng)模型,在此基礎(chǔ)上采用Wester blot技術(shù)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的變化,采用HE染

4、色觀察平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度的變化,并用共聚焦顯微鏡觀察并檢測(cè)Calcein AM、Ca2+、IP3在SMC與SMC、SMC與EC間縫隙連接的交流情況。
　　4.Cx43表達(dá)量的降低對(duì)腦血管痙攣體外模型信號(hào)通訊的影響:利用shRNA-Cx43腺病毒感染平滑肌細(xì)胞,采用同樣方法構(gòu)建腦血管痙攣雙層共培養(yǎng)模型,在此基礎(chǔ)上采用Wester blot技術(shù)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的變化,采用HE染色觀察平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度的變化,并用共聚焦顯微鏡觀察并檢

5、測(cè)Calcein AM、Ca2+、IP3在SMC與SMC、SMC與EC間縫隙連接的交流情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功培養(yǎng)出原代基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,經(jīng)光鏡觀察及細(xì)胞免疫熒光鑒定,平滑肌細(xì)胞形態(tài)正確,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,純度較高;
　　2.成功構(gòu)建PAV.KdSi.U/eGFP-U6-shCx43質(zhì)粒,病毒包裝7d后可見病毒病變斑(CPE)形成,病毒原液(P0)滴度為1.07×1011 PFU/mL,當(dāng)MOI值取100時(shí),感染

6、效率最高。經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cx43在24h表達(dá)水平最低,之后基本保持穩(wěn)定,感染達(dá)到預(yù)期效果。
　　3.通過檢測(cè)正常平滑肌細(xì)胞、OxyHb刺激24h、OxyHb刺激48h、OxyHb刺激72h時(shí)Cx43表達(dá)情況及平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度,發(fā)現(xiàn)OxyHb刺激后Cx43表達(dá)量逐漸增加,在48h時(shí)到達(dá)高峰,之后又逐漸下降。平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度變化情況與Cx43表達(dá)相符,在OxyHb刺激后平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度縮短,在48h時(shí)到達(dá)高峰,之后又逐漸

7、增加。當(dāng)使用腺病毒感染降低平滑肌Cx43的表達(dá)后,OxyHb刺激后平滑肌細(xì)胞收縮強(qiáng)度有所緩解,長(zhǎng)度較未感染前增加。
　　4.通過激光共聚焦顯微鏡觀察分析雙層細(xì)胞共培養(yǎng)模型上“受體細(xì)胞”的熒光強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)shRNA-Cx43腺病毒感染平滑肌后,能夠減弱染料Calcein AM和Ca2+在平滑肌細(xì)胞間的傳輸,同時(shí)也可以減弱IP3從平滑肌細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的傳輸。各組“對(duì)照細(xì)胞”均無熒光出現(xiàn),說明各信號(hào)分子由縫隙連接在細(xì)胞間傳輸。
　　

8、結(jié)論:
　　1.SMCs上Cx43表達(dá)隨著OxyHb刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,同時(shí)SMCs長(zhǎng)度逐漸變短,在48h到達(dá)高峰,之后逐漸恢復(fù);降低SMCs上Cx43的表達(dá)后能有效的緩解平滑肌細(xì)胞收縮;Cx43表達(dá)量的改變與SMCs收縮有關(guān)。
　　2.Cx43表達(dá)量的改變能夠影響非特異性物質(zhì)Calcein AM和收縮因子Ca2+在平滑肌細(xì)胞間的交流,同時(shí)也會(huì)影響IP3在SMCs與VECs間的傳輸,Cx43表達(dá)量越高,縫隙連接對(duì)這些物質(zhì)