縫隙連接在腦血管痙攣病理機制中作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后不同時間段大鼠基底動脈縫隙連接通道(GJ)變化與腦血管痙攣(CVS)的關(guān)系,即觀察基底動脈（BAs）在SAH后不同時間段基底動脈縫隙連接通道電生理變化及檢測縫隙連接蛋白（conexins Cxs）表達變化與CVS的關(guān)系，且給予縫隙連接阻斷劑18β-甘草次酸對該通道的調(diào)節(jié)作用,為更深入研究SAH后CVS的發(fā)生機制奠定理論依據(jù)，為今后臨床病人SAH后CVS的預防及治療提供新的藥物靶點和途

2、徑。
　　方法：
　　實驗分組：Sprague Dawley大鼠共120只,隨機數(shù)字表法分4組：對照組（n=30）、假手術(shù)組（n=30）、手術(shù)組（n=30）、治療組（n=30），每組隨機數(shù)字表法分成5亞組（n=6），即第1d、3d、5d、7d、14d。
　　模型建立及藥物處理：同種型雄性Sprague Dawley大鼠采用視交叉前池二次注血法建立SAH模型，治療組二次注血后第1d腹腔注射縫隙連接阻斷劑18β-甘草次酸（

3、10mg/kg）進行干預，以后每日一次，直至各時間段處死。
　　神經(jīng)行為學評分：參考Kaoutzanis M等的神經(jīng)行為學評分法，從運動反應、睜眼反應及飲食三方面分別對各組模型鼠術(shù)后第1d、3d、5d、7d、14d對模型大鼠進行神經(jīng)行為學評分，評分范圍3至11分，3分最差，11分正常。
　　模型鑒定：各組模型鼠麻醉后，取腦于10％福爾馬林溶液中固定24h行HE染色。光鏡下觀察蛛網(wǎng)膜下腔出血及血管形態(tài)學變化。
　　腦血管

4、直徑測量：各組模型鼠麻醉后，斷頭取腦將剝?nèi)?-3mm基底動脈移入灌流槽內(nèi)固定。用Myoview軟件控制血管內(nèi)壓力穩(wěn)定在60mmHg、溫度37℃，測基底動脈外徑。
　　腦血管Cxs表達檢測：各組模型鼠麻醉后，斷頭取腦于0.9%生理鹽水中，解剖顯微鏡下剝?nèi)ツX血管液氮速凍，提取總蛋白，western blotting技術(shù)檢測Cx37、Cx40、Cx43、Cx45。
　　觀察GJ電導率變化：不同時間段麻醉模型鼠，剝?nèi)ブ睆?0-80u

5、m，長0.4mm腦血管，進行消化處理后，使用AXON700B放大器在電壓膜片鉗下記錄一段腦微血管縫隙連接通道電生理變化。
　　結(jié)果：
　　建立SAH模型及鑒定：SAH后通過HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔可見大量陳舊性積血，SAH后基底動脈明顯痙攣，形態(tài)學發(fā)生明顯變化，給予18β-甘草次酸后明顯緩解。
　　神經(jīng)行為學評分變化：SAH后大鼠神經(jīng)行為學評分第3d開始下降，至第7d降至最低，第14d出現(xiàn)恢復，給予18β-甘

6、草次酸后明顯改善。
　　基底動脈直徑測量：SAH后基底動脈外徑第1d開始縮窄，至第7d達最小，第14d開始恢復變粗，給予18β-甘草次酸后明顯變粗。
　　腦血管縫隙連接蛋白表達：
　　1）Cx37蛋白未檢測到。
　　2）Cx40蛋白表達檢測：SAH后第3dCx40蛋白表達濃度開始下降，至第7d達最低值，第14d開始恢復升高，治療組未見顯著變化。
　　3）Cx43、Cx45蛋白表達檢測：SAH后第1dCx43

7、蛋白表達濃度開始升高，至第7d達最高值，第14d開始降低，治療組未見顯著變化。
　　縫隙連接通道電導率變化：SAH后第1d縫隙連接通道電導率開始升高，至第7d達最高值，第14d開始降低，治療組未見顯著變化。
　　結(jié)論：
　　視交叉前池二次注血法可以成功建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。
　　SAH后CVS的發(fā)生與腦血管GJ形態(tài)結(jié)構(gòu)及電生理變化相關(guān)。
　　18β-甘草次酸可緩解SAH后CVS的發(fā)生，其機制可能與腦血管G