自噬調(diào)控人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　近年來，關(guān)于MSCs（mesenchymal stem cells）的相關(guān)研究已經(jīng)很多，并報(bào)道被用于治療人類多種疾病。前期的研究表明，在動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)中，應(yīng)用 MSCs可以有效緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及促進(jìn)組織再生。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果也證明， MSCs可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合過程中的血管化，并抑制皮膚增生性瘢痕的形成。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMMSCs）是從骨髓中

2、分離提取出來的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，已經(jīng)被大家公認(rèn)并被廣泛應(yīng)用于臨床。頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（jaw of bone marrow mesenchymal stem cells，JBMMSCs）是來源于口腔中頜骨組織的一種成體干細(xì)胞，具有與BMMSCs相類似的克隆形成能力及多向分化潛能。然而微環(huán)境的改變（如炎癥）嚴(yán)重影響JBMMSCs的生物學(xué)性能（如旁分泌功能），是導(dǎo)致其治療效果下降的重要原因。
　　自噬（autophagy）是胞內(nèi)囊泡

3、通過包裹錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器（如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）并與溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），將其內(nèi)容物降解并循環(huán)利用的行為，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝平衡及胞內(nèi)細(xì)胞器的更新。胞外信號(hào)調(diào)控激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）是一個(gè)很重要的調(diào)控細(xì)胞功能的激酶，并且與ATGs（autophagy-related genes）蛋白相互作用，當(dāng)敲除ATG5/7時(shí)會(huì)減少ERK的

4、磷酸化。有研究報(bào)道自噬調(diào)控BMMSCs的功能從而提高其治療效果，但是關(guān)于自噬在 JBMMSCs的旁分泌功能中起著何種作用及其作用機(jī)制并不是很明確。因此，在本課題中，我們首先比較了正常及炎癥組織來源 JBMMSCs的自噬水平及其促ECs血管生成能力的不同，其次，研究了自噬對(duì)JBMMSCs旁分泌功能的調(diào)控及作用機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs的旁分泌功能以及對(duì)JBMMSCs生物學(xué)性能的深入研究提供了新的思路。
　　【研究目的】
　

5、　1.探討炎癥微環(huán)境對(duì)JBMMSCs的成骨及促ECs血管化功能的影響；
　　2.探討炎癥微環(huán)境對(duì)JBMMSCs自噬水平的影響；
　　3.探討自噬通過調(diào)控JBMMSCs的旁分泌功能從而影響ECs的血管化功能；
　　4.探討通過上調(diào)P-JBMMSCs的自噬水平逆轉(zhuǎn)其促ECs的血管化功能；
　　5.探討自噬調(diào)控JBMMSCs的旁分泌功能及作用機(jī)制。
　　【研究方法】
　　第一部分：正常及炎癥組織來源的JBM

6、MSCs生物學(xué)性能的比較。首先，我們從臨床上收集了頜骨骨髓炎患者的頜骨組織，參照正常頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（H-JBMMSCs）的分離培養(yǎng)方法，成功分離并培養(yǎng)了炎癥組織來源的頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（P-JBMMSCs）。其次，采用MTT、克隆形成（colony forming unit-fibroblasts，CFU-F）、成骨成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。最后，我們通過ALP、茜素紅染色和 western blot檢測(cè)進(jìn)一步比較

7、了兩種細(xì)胞成骨分化能力的差異，以及Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)與之共培養(yǎng)后ECs脈管形成能力的差異。
　　第二部分：炎癥組織來源的JBMMSCs自噬水平的變化。首先，我們通過western blot和RT-PCR檢測(cè)了H-JBMMSCs和P-JBMMSCs中自噬相關(guān)基因LC3和Beclin-1的表達(dá)變化，同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察了LC3在細(xì)胞中的表達(dá)及分布情況，最后通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞中自噬體的超微結(jié)構(gòu)及形成數(shù)量。

8、　　第三部分：自噬調(diào)節(jié)JBMMSCs促ECs血管化。為了明確自噬在JBMMSCs促ECs血管化功能方面的作用，我們利用 Rapamycin上調(diào)或轉(zhuǎn)染 si-Beclin-1下調(diào)JBMMSCs的自噬水平，western blot檢測(cè)與其共培養(yǎng)后ECs中成血管相關(guān)蛋白VEGF、AngII、PCNA的表達(dá)水平，Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)ECs脈管形成能力。在此過程中排除了自噬對(duì) ECs血管生成能力的直接影響。同時(shí)建立皮膚創(chuàng)面模型對(duì)體外結(jié)果進(jìn)行

9、驗(yàn)證，觀察注射JBMMSCs后第7天和14天創(chuàng)面愈合的大體照片，HE染色觀察創(chuàng)面愈合情況，倒置顯微鏡觀察創(chuàng)面愈合處新生毛細(xì)血管以及免疫熒光檢測(cè)創(chuàng)面愈合處血管相關(guān)因子CD31的表達(dá)。
　　第四部分：Rapamycin逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs促 ECs的血管化。為了明確自噬和P-JBMMSCs促ECs血管生成能力下降的相關(guān)性，我們利用自噬的激活劑Rapamycin上調(diào)P-JBMMSCs的自噬水平后，western blot檢測(cè)與其共培養(yǎng)

10、后ECs成血管相關(guān)蛋白VEGF、AngII、PCNA的表達(dá)水平，Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)ECs脈管形成能力。進(jìn)一步建立皮膚創(chuàng)面模型對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，觀察注射細(xì)胞后第7天和14天創(chuàng)面的愈合大體照片， HE染色觀察創(chuàng)面愈合情況以及免疫熒光檢測(cè)創(chuàng)面愈合處血管相關(guān)因子CD31的表達(dá)。
　　第五部分：自噬通過調(diào)控ERK通路促進(jìn)JBMMSCs旁分泌VEGF。為了明確自噬是通過調(diào)控JBMMSCs的旁分泌功能從而影響ECs的血管生成能力。我們首先通

11、過RT-PCR篩選出與自噬關(guān)系最為密切的成血管因子，并驗(yàn)證該因子在ECs血管生成中的作用。進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ERK和LC3的結(jié)合情況，western blot檢測(cè)Raf-MEK-ERK通路上相關(guān)蛋白的變化，抑制ERK通路后檢測(cè)VEGF是否發(fā)生變化，明確自噬是通過Raf-MEK-ERK通路調(diào)控JBMMSCs旁分泌VEGF。
　　【研究結(jié)果】
　　第一部分：正常和炎癥組織來源的JBMMSCs成骨及促ECs血管生成能力的

12、比較。
　　1.成功地從正常及炎癥組織中分離培養(yǎng)出 JBMMSCs，并驗(yàn)證其具有增殖能力及多向分化潛能；
　　2.和H-JBMMSCs相比，P-JBMMSCs的成骨分化能力顯著下降；
　　3.Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)P-JBMMSCs促ECs脈管生成能力也顯著低于H-JBMMSCs。
　　第二部分：炎癥組織來源的JBMMSCs中自噬水平降低。
　　1.Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示P-JB

13、MMSCs中自噬相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)均下降；
　　2.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示P-JBMMSCs中LC3的表達(dá)減弱；
　　3.透射電子顯微鏡觀察，結(jié)果顯示P-JBMMSCs中無明顯的自噬體形成。
　　第三部分：自噬正向調(diào)節(jié)JBMMSCs促ECs血管生成能力。
　　1. Rapamycin不能直接調(diào)控ECs的血管化功能；
　　2.皮下注射細(xì)胞的方式較靜脈注射的方式更能促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合；
　　3.利用Rap

14、amycin或轉(zhuǎn)染si-Beclin-1改變JBMMSCs的自噬水平，其促ECs血管生成能力也隨之改變；
　　4. JBMMSCs自噬表達(dá)的改變對(duì)其凋亡無影響；
　　5.進(jìn)一步的體內(nèi)結(jié)果表明，自噬可以調(diào)控JBMMSCs促進(jìn)創(chuàng)面皮膚血管化，從而加速創(chuàng)面的愈合。
　　第四部分：Rapamycin逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs促ECs的血管生成能力。
　　1.單純涂抹Rapamycin對(duì)皮膚創(chuàng)面的愈合無明顯促進(jìn)作用；
　

15、　2.Rapamycin逆轉(zhuǎn)P-JBMMSCs促ECs血管新生能力；
　　3.皮下注射Rapamycin激活后的P-JBMMSCs，可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的血管新生，進(jìn)一步加速創(chuàng)面的愈合。
　　第五部分：自噬通過激活ERK通路促進(jìn)JBMMSCs旁分泌VEGF。
　　1．通過RT-PCR成功地篩選出與自噬相關(guān)的促血管生成因子VEGF;
　　2．體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都得出，Rapamycin組VEGF的表達(dá)升高；
　　3

16、．VEGF促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合過程中的血管化；
　　4．Rapamycin借助Raf-MEK-ERK通路激活JBMMSCs旁分泌功能，從而促進(jìn)VEGF的分泌。
　　【研究結(jié)論】
　　1.本課題成功地從正常及炎癥組織中分離培養(yǎng)了頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)其增殖、克隆形成及成骨成脂分化能力進(jìn)行了鑒定。通過進(jìn)一步比較H-JBMMSCs和P-JBMMSCs生物學(xué)性能，發(fā)現(xiàn)炎癥因素導(dǎo)致頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨及促ECs血管生成能

17、力下降。
　　2.炎癥微環(huán)境影響頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自噬水平下降，這是導(dǎo)致頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促ECs血管功能下降的重要原因。
　　3.自噬在JBMMSCs促ECs血管化方面發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用。Rapamycin可以激活JBMMSCs促ECs的血管新生，而通過si-Beclin-1抑制細(xì)胞的自噬水平后，其JBMMSCs促ECs血管新生的能力降低。
　　4.上調(diào)P-JBMMSCs的自噬水平，可以逆轉(zhuǎn)其對(duì)ECs血管

18、化功能的作用。
　　5.自噬借助Raf-MEK-ERK通路激活JBMMSCs的旁分泌功能，促進(jìn)VEGF的分泌。分泌的VEGF作用于ECs，從而增強(qiáng)其血管新生能力。
　　綜合以上結(jié)果，我們得出結(jié)論炎癥微環(huán)境影響JBMMSCs促ECs的血管化功能，然而自噬通過激活JBMMSCs的旁分泌VEGF從而正向調(diào)節(jié)其促ECs的血管化。本研究不僅加深了解了炎癥微環(huán)境對(duì)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)性能的影響，而且明確自噬在頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞