缺氧對骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化調(diào)控的體外研究.pdf

1、以成骨細胞為中心的骨改建是正畸牙移動的生物學基礎(chǔ)，骨對機械力的反應(yīng)是通過什么機制進行的目前并沒有完全明了。但有一點是肯定的，在正畸力作用下由于壓力側(cè)受壓導(dǎo)致血供減少，形成了缺氧的微環(huán)境。有學者推測，氧分壓的改變可能是骨改建中潛在的扳機點“trigger”。現(xiàn)已證實間充質(zhì)干細胞(MSCs)是成骨細胞的日仃體細胞，體外經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨細胞分化。關(guān)于缺氧對骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化的影響及調(diào)控機理目前尚不清楚。 本研究擬通過體外分離、純化

2、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，建立骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導(dǎo)分化細胞模型，采用Jouan三氣缺氧培養(yǎng)體系；運用熒光標記技術(shù)、酶比活力定量檢測、實時熒光定量PCR及Westernblotting蛋白免疫印跡等先進技術(shù)方法，研究不同作用時間的缺氧對骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化中體現(xiàn)成骨功能效應(yīng)的堿性磷酸酶(ALP)比活性、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(0C)基因及骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Cbfal)基因和蛋白表達的影響；并對其絲裂原活化蛋白激酶(MAP

3、Ks)信號通路中的ERK和P38通路的調(diào)控機制進行初步探索。從細胞和分子生物學水平上深入系統(tǒng)地探討機械力介導(dǎo)的微環(huán)境缺氧對骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化的調(diào)控，從而為進一步闡明正畸牙移動骨改建機理奠定實驗基礎(chǔ)。 結(jié)果顯示： 1．通過密度梯度離心法成功分離培養(yǎng)了rMSCs，結(jié)合貼壁法獲得了較高純度的3～5代rMSCs，并經(jīng)骨向誘導(dǎo)可成功培養(yǎng)出具有成骨細胞表型的rBMSCs。 2．缺氧對rBMSCs骨向誘導(dǎo)分化中ALPas

4、e、比活性ALPase及OC mRNA的表達在作用的前12h均有一過性的升高作用，但無統(tǒng)計學意義；隨作用時間的延長，有較明顯的抑制作用，其中mRNA表達在72h和96h抑制效應(yīng)最強，具有時效性。 3．Cbfal／OSF2 mRNA的表達在缺氧48h后非常下降顯著，幾乎不表達，72h和96t1分別下調(diào)了90％和89％；而其蛋白水平雖不如基因改變明顯，但仍呈下降趨勢，在96h也下調(diào)了63％。 4．缺氧培養(yǎng)下5min ER

5、Kl／2 MAPK信號通路被迅速激活，磷酸化程度升至Omin對照組的231％； 15min時有所回落，但仍維持較高激活水平；隨后在45min時迅速下降，與135min和6h時一樣維持在一基線水平。而P38 NAPK信號通路蛋白磷酸化水平無明顯變化，維持在一基線水平，各時間點之間沒有統(tǒng)汁學差別。 結(jié)論及提示： 1．rMSCs骨向誘導(dǎo)可成功模擬整個成骨細胞分化過程，為后續(xù)研究提供細胞學模型。 2．2％缺氧通過下調(diào)成

6、骨功能蛋白ALPase酶活性、ALPase及OC基因表達對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導(dǎo)分化成骨效應(yīng)有抑制作用。 3．2％缺氧對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導(dǎo)分化中作為成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的核心結(jié)合因子Cbfal基因和蛋白表達的均有顯著抑制作用。 4．ERKl／2 MAPK信號通路參與了缺氧抑制rBMSCs骨向誘導(dǎo)分化的調(diào)控過程：而P38 MAPK信號通路沒有被激活，可能不參與調(diào)控。 缺氧很有可能就是通過抑制成骨

7、細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子cbfal這一關(guān)鍵節(jié)點下調(diào)ALPase及OC等這些代表成骨細胞功能狀態(tài)的酶和細胞外基質(zhì)蛋白的表達對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化起抑制調(diào)控作用；而細胞對外界缺氧的應(yīng)激很有可能是通過激活了ERKl／2 MAPK信號通路的級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)Cbf α 1活性和表達發(fā)揮調(diào)控作用，由于間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)問題的網(wǎng)絡(luò)性和復(fù)雜性，尚不能說明其唯一性和重要性，但至少肯定參與了此調(diào)控過程。 推測可能調(diào)控機制:缺氧應(yīng)激→