YAP在哮喘發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)情況及其功能探討.pdf

1、目的：
　　哮喘的主要特點(diǎn)是炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和組織重構(gòu)與結(jié)構(gòu)變化，其中包括氣管上皮纖維化和ASM細(xì)胞增殖。Hippo通路是一個(gè)關(guān)鍵的哮喘機(jī)制，主要監(jiān)管并參與細(xì)胞增殖，成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分化。
　　為了揭示哮喘和 Hippo之間是否存在顯著性的關(guān)系，作為 Hippo通路機(jī)制中最重要的基因靶點(diǎn)-YAP蛋白的表達(dá)，則是主要的指針。我們通過(guò)慢性哮喘的支氣管平滑肌模型(CAM)對(duì)該蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究。
　　方法：
　　

2、1：40只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和模型實(shí)驗(yàn)組（利用雞卵清蛋白(OVA)誘喘制成慢性哮喘的支氣管平滑肌模型）。模型建立之后，通過(guò)HE染色法對(duì)空白對(duì)照組和模型實(shí)驗(yàn)組的老鼠在肺組織的病理變化方面進(jìn)行觀察。用免疫組織化學(xué)(IHC)的方法檢測(cè)是否存在YAP肺組織蛋白表達(dá)。
　　2：通過(guò)構(gòu)建shRNA抑制YAP在mRNA和蛋白水平上的特異性表達(dá)，研究溶血性脂肪酸流（LPA）和鞘氨醇-1-磷酸鹽（S1P）通過(guò)對(duì)YAP以及人氣道平滑肌細(xì)胞（air

3、way smooth muscle cells，ASMCs）的影響。
　　結(jié)果：
　　模型實(shí)驗(yàn)組的病理變化表明，經(jīng)過(guò)誘喘的小鼠存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，主要包括淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，還存在特定的氣道平滑肌增生的現(xiàn)象；
　　IHC結(jié)果表明，模型實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的YAP蛋白質(zhì)在表達(dá)中相比，有顯著增加(P<0.01)。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和免疫印跡手段分析檢測(cè)到的YAP基因(P<0.

4、01)表達(dá)在模型實(shí)驗(yàn)組是有上調(diào)證據(jù)的準(zhǔn)確性；
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，被 shYAP慢病毒條件轉(zhuǎn)染24h及以上的時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)shYAP慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)ASMCs細(xì)胞內(nèi)YAP表達(dá)的抑制效應(yīng)，即轉(zhuǎn)染是成功的，其質(zhì)粒也是有效的；
　　而采用LPA和S1P對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期以及短期的干預(yù)均能夠增加ankrd1基因及其下游基因CTGF的表達(dá)，從而顯著的增加YAP的活性；采用shyap抑制YAP細(xì)胞的表達(dá)，然后加入對(duì)ASMCs干預(yù)LPA和S1P，結(jié)果

5、發(fā)現(xiàn)shyap轉(zhuǎn)染CTGF和ankrd1，YAP和PCNA的表達(dá)減少，當(dāng)YAP受到抑制時(shí)，細(xì)胞的增殖也一定程度的受到影響；
　　最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)YAP對(duì)ASMCs細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)YAP的活性與細(xì)胞S期以及G2/M的細(xì)胞量存在著一定的相關(guān)性，即YAP活性越高，處于S期以及G2/M的細(xì)胞量就會(huì)越多，進(jìn)一步說(shuō)明YAP能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　總之，與空白對(duì)照組相比，在哮喘中，YAP蛋白具有明顯表達(dá)，同時(shí)