microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的異常表達(dá)及其功能研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類尚未攻克的醫(yī)學(xué)難題，絕大多數(shù)癌癥給人類帶來巨大的生命威脅。目前對(duì)惡性實(shí)體腫瘤的治療仍以手術(shù)切除和放化療為主，在清除癌細(xì)胞的同時(shí)給機(jī)體帶來傷害甚至是致命的打擊?；蛑委熝芯恐饾u成為熱點(diǎn)。研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可以為開發(fā)新的治療手段提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。microRNA，一個(gè)不足30個(gè)核苷酸的微小分子以其復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和對(duì)細(xì)胞的多方面生物學(xué)行為影響成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域的另一熱點(diǎn)。它和腫瘤疾病之間的密切聯(lián)系已經(jīng)為人們所熟知

2、，而其中具體的分子機(jī)制研究卻并不透徹。腫瘤細(xì)胞自身所特有的物質(zhì)能量代謝特征，其中隱藏的分子機(jī)制可以作為治療腫瘤的一個(gè)切入點(diǎn)。本課題期望在已有的研究成果上，深入分析miRNA和惡性腫瘤之間包括表達(dá)、物質(zhì)能量代謝等多方面的調(diào)控關(guān)系，為尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)探明機(jī)制。
　　 第一部分：Ras信號(hào)通路對(duì)miRNA表達(dá)調(diào)控的研究
　　 目的：研究Ras信號(hào)通路對(duì)miRNA表達(dá)的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　 方法：以RAS蛋白

3、轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞和正常NIH3T3細(xì)胞為研究對(duì)象，利用microRNA芯片技術(shù)篩選兩株細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs，利用real-timePCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果。選出表達(dá)改變較為明顯的6個(gè)miRNAs應(yīng)用普通PCR和real-timePCR檢測(cè)其不同結(jié)構(gòu)體的表達(dá)水平。通過分析不同結(jié)構(gòu)體的表達(dá)水平，尋找其差異表達(dá)的原因。通過構(gòu)建包含miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)域熒光報(bào)告載體分析miRNA基因啟動(dòng)子活性，研究其受調(diào)控的可能分子機(jī)制。

4、　　 結(jié)果：①microRNA芯片篩選到大量差異表達(dá)的miRNAs；②real-timePCR驗(yàn)證芯片結(jié)果，挑選表達(dá)改變較為明顯的6個(gè)miRNAs進(jìn)行后續(xù)研究；③不同結(jié)構(gòu)體表達(dá)水平的分析表明6個(gè)miRNAs受到了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；④啟動(dòng)子區(qū)域熒光報(bào)告載體熒光素酶活性分析獲得有活性的啟動(dòng)子片段。
　　 結(jié)論：RAS蛋白轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞中存在與正常NIH3T3細(xì)胞不同的miRNAs表達(dá)調(diào)控機(jī)制，使得miRNA發(fā)生了差異表達(dá)。<

5、br>　　 第二部分：microRNA與腫瘤細(xì)胞谷氨酰胺代謝調(diào)控
　　 目的：通過研究谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)在大腸癌中的作用和表達(dá)調(diào)控機(jī)制，明確腫瘤細(xì)胞代謝異常的表觀遺傳基礎(chǔ)，尋找干預(yù)治療它的策略。
　　 方法：①用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)大腸癌細(xì)胞中GLS蛋白表達(dá)情況；②應(yīng)用GLS-siRNA敲除腸癌細(xì)胞系GLS蛋白表達(dá)后用MTS方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；③利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GLS蛋白敲除

6、后細(xì)胞凋亡情況及應(yīng)用OAA/NAC后對(duì)凋亡的影響；④利用ATP檢測(cè)試劑盒分析抑制GLS蛋白后細(xì)胞能量改變；⑤通過real-timePCR檢測(cè)腸癌組織和細(xì)胞中miR-137表達(dá)情況；⑥用miR-137mimic敲除腸癌細(xì)胞系GLS蛋白表達(dá)后用MTS方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；⑦應(yīng)用一個(gè)誘導(dǎo)APC蛋白表達(dá)引起內(nèi)源性miR-137表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)胞模型分析miR-137和GLS蛋白的靶標(biāo)關(guān)系；⑧構(gòu)建野生型和突變型pMIR-GILS-3'-UTR熒光

7、報(bào)告載體直接證明miR-137和GLS蛋白的相互作用。
　　 結(jié)果：①WesternBlot結(jié)果說明大腸癌細(xì)胞系GLS蛋白表達(dá)上調(diào)；②應(yīng)用GLS-siRNA敲除腸癌細(xì)胞系GLS蛋白表達(dá)后用MTS方法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用；③流式細(xì)胞儀檢測(cè)GLS蛋白敲除后細(xì)胞凋亡增多，應(yīng)用OAA/NAC后凋亡有所減少；④ATP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑制GLS蛋白后細(xì)胞能量產(chǎn)生反而有所增多；⑤real-timePCR檢測(cè)腸癌組織和細(xì)胞中miR-137表達(dá)

8、下調(diào)；⑥用miR-137mimic敲除腸癌細(xì)胞系GLS蛋白表達(dá)后用MTS方法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖有抑制效果；⑦誘導(dǎo)APC蛋白表達(dá)后real-timePCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性miR-137表達(dá)增強(qiáng)，WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞GLS蛋白表達(dá)下降，應(yīng)用miR-137inhibitor后發(fā)現(xiàn)GLS蛋白表達(dá)有所恢復(fù)，且MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制也消失；⑧pMIR-GLS-3’-UTR熒光報(bào)告載體證明miR-137和GLS蛋白存在直接相互作用。