microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的異常表達及其功能研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類尚未攻克的醫(yī)學難題，絕大多數癌癥給人類帶來巨大的生命威脅。目前對惡性實體腫瘤的治療仍以手術切除和放化療為主，在清除癌細胞的同時給機體帶來傷害甚至是致命的打擊?；蛑委熝芯恐饾u成為熱點。研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制可以為開發(fā)新的治療手段提供理論依據和實驗基礎。microRNA，一個不足30個核苷酸的微小分子以其復雜的信號網絡和對細胞的多方面生物學行為影響成為醫(yī)學科學研究領域的另一熱點。它和腫瘤疾病之間的密切聯系已經為人們所熟知

2、，而其中具體的分子機制研究卻并不透徹。腫瘤細胞自身所特有的物質能量代謝特征，其中隱藏的分子機制可以作為治療腫瘤的一個切入點。本課題期望在已有的研究成果上，深入分析miRNA和惡性腫瘤之間包括表達、物質能量代謝等多方面的調控關系，為尋找新的腫瘤治療靶點探明機制。
　　 第一部分：Ras信號通路對miRNA表達調控的研究
　　 目的：研究Ras信號通路對miRNA表達的調控作用及其分子機制。
　　 方法：以RAS蛋白

3、轉化的NIH3T3細胞和正常NIH3T3細胞為研究對象，利用microRNA芯片技術篩選兩株細胞中差異表達的miRNAs，利用real-timePCR技術驗證芯片結果。選出表達改變較為明顯的6個miRNAs應用普通PCR和real-timePCR檢測其不同結構體的表達水平。通過分析不同結構體的表達水平，尋找其差異表達的原因。通過構建包含miRNA基因啟動子區(qū)域熒光報告載體分析miRNA基因啟動子活性，研究其受調控的可能分子機制。

4、　　 結果：①microRNA芯片篩選到大量差異表達的miRNAs；②real-timePCR驗證芯片結果，挑選表達改變較為明顯的6個miRNAs進行后續(xù)研究；③不同結構體表達水平的分析表明6個miRNAs受到了轉錄水平的調控；④啟動子區(qū)域熒光報告載體熒光素酶活性分析獲得有活性的啟動子片段。
　　 結論：RAS蛋白轉化的NIH3T3細胞中存在與正常NIH3T3細胞不同的miRNAs表達調控機制，使得miRNA發(fā)生了差異表達。<

5、br>　　 第二部分：microRNA與腫瘤細胞谷氨酰胺代謝調控
　　 目的：通過研究谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)在大腸癌中的作用和表達調控機制，明確腫瘤細胞代謝異常的表觀遺傳基礎，尋找干預治療它的策略。
　　 方法：①用WesternBlot技術檢測大腸癌細胞中GLS蛋白表達情況；②應用GLS-siRNA敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測對細胞增殖的影響；③利用流式細胞儀檢測GLS蛋白敲除

6、后細胞凋亡情況及應用OAA/NAC后對凋亡的影響；④利用ATP檢測試劑盒分析抑制GLS蛋白后細胞能量改變；⑤通過real-timePCR檢測腸癌組織和細胞中miR-137表達情況；⑥用miR-137mimic敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測對細胞增殖的影響；⑦應用一個誘導APC蛋白表達引起內源性miR-137表達增強的細胞模型分析miR-137和GLS蛋白的靶標關系；⑧構建野生型和突變型pMIR-GILS-3'-UTR熒光

7、報告載體直接證明miR-137和GLS蛋白的相互作用。
　　 結果：①WesternBlot結果說明大腸癌細胞系GLS蛋白表達上調；②應用GLS-siRNA敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測其對細胞增殖有明顯抑制作用；③流式細胞儀檢測GLS蛋白敲除后細胞凋亡增多，應用OAA/NAC后凋亡有所減少；④ATP檢測發(fā)現抑制GLS蛋白后細胞能量產生反而有所增多；⑤real-timePCR檢測腸癌組織和細胞中miR-137表達

8、下調；⑥用miR-137mimic敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測其對細胞增殖有抑制效果；⑦誘導APC蛋白表達后real-timePCR檢測細胞內源性miR-137表達增強，WesternBlot檢測細胞GLS蛋白表達下降，應用miR-137inhibitor后發(fā)現GLS蛋白表達有所恢復，且MTS檢測細胞增殖抑制也消失；⑧pMIR-GLS-3’-UTR熒光報告載體證明miR-137和GLS蛋白存在直接相互作用。