肝癌發(fā)生過程中的差異基因表達(dá)譜研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular，carcinoma，HCC，簡稱肝癌)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位，死因第3位；其發(fā)病率和死亡率有逐年上升趨勢。我國乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌發(fā)生的主要原因，每年死于肝癌的人數(shù)達(dá)到11萬，居我國癌癥死亡的第二位。肝癌發(fā)病十分隱匿，臨床上僅有不到30％的病人就診時(shí)可獲得手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。對(duì)大多數(shù)中晚期患者

2、，治療的選擇很局限，預(yù)后兇險(xiǎn)。肝癌自然病程短，進(jìn)展快，病死率高，嚴(yán)重威脅著我國國民的健康和生命。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多病因、多階段、多因素參與的過程。肝癌的發(fā)生一般要經(jīng)過慢性肝炎→肝硬化→肝癌的病理過程，其中涉及到眾多基因異常表達(dá)改變。抑癌基因的突變?nèi)笔А┗虻漠惓U(kuò)增與表達(dá)、多基因的協(xié)同作用，基因本身的多效性以及機(jī)體免疫因素決定最終腫瘤表型的表達(dá)。用一次只能檢測少量基因且操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法研究肝癌基因改變有很大的局限性

3、，新近發(fā)展的基因表達(dá)分析平臺(tái)——基因芯片技術(shù)以其自身的高通量、微量化、平行化、自動(dòng)化檢測優(yōu)點(diǎn)從眾多方法中脫穎而出?；蛐酒夹g(shù)是以微陣列方式將大量特定高密度寡核苷酸或基因片段固定在某種介質(zhì)(玻片、硅片、尼龍膜等)上，檢測特定基因表達(dá)的一項(xiàng)技術(shù)。基因芯片技術(shù)的理論基礎(chǔ)是核酸雜交。基因芯片技術(shù)可以準(zhǔn)確高效的同時(shí)在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)分析待測樣本中成千上萬個(gè)基因的表達(dá)情況以及它們之間相互作用的關(guān)系。本研究采用含19378個(gè)已知基因的Affyme

4、trixU133 plus2.0寡核苷酸基因芯片研究正常肝臟、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌組織基因表達(dá)譜，對(duì)共同表達(dá)的差異基因進(jìn)行分析，探討相關(guān)基因變化與肝癌發(fā)生過程中的可能內(nèi)在聯(lián)系。 材料與方法正常肝組織9例，慢性乙型肝炎(以下簡稱肝炎)組織13例，乙型肝炎肝硬化(以下簡稱肝硬化)組織6例，HBV相關(guān)性肝癌組織15例。肝炎組織取自安陽市五院2006年2月～2006年4月肝活檢組織，余均取自河南省人民醫(yī)院2005年3月～2005年

5、6月肝臟手術(shù)切除組織(正常肝組織取自健康供體)。肝炎、肝硬化、肝癌組織標(biāo)本HBsAg均陽性，正常肝組織HBsAg陰性。疾病診斷均經(jīng)病理證實(shí)。標(biāo)本取出后迅速置于液氮冷凍，凍存待用。按：Invitrogen公司的Trizol試劑盒操作程序Trizol一步法抽提正常肝組織及肝炎、肝硬化和肝癌組織總RNA。使用QIAGEN公司的QIAGEN RNeasy Kit進(jìn)一步純化總RNA。瓊脂糖凝膠電泳(180V，0.5h)檢測總RNA的28S和18s

6、比例，以評(píng)估總RNA的完整性；用分光光度計(jì)在260/280nm測定總RNA吸光度，以計(jì)算總RNA的純度。按Affymetrix公司芯片制作要求，進(jìn)行生物素標(biāo)記的cRNA．合成，并將其片段化處理。然后分別與含有19378個(gè)已知基因的寡核苷酸芯片進(jìn)行雜交，Gene array Scanner3000 7G激光共聚焦掃描，采用GenePix Pro 3．0軟件讀取芯片探針信號(hào)并進(jìn)行扣本底、標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算基因的Ratio值(肝炎、肝硬化、肝癌

7、芯片探針信號(hào)/正常肝組織芯片對(duì)應(yīng)探針信號(hào))。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：Ratio≥2為上調(diào)基因，Ratio≤0.5為下調(diào)基因。采用Microsoft Excel及Gominer軟件對(duì)差異基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。查閱NCBI(http：//www．pubmed．com)，GENEONTOLOGY(http：//www．geneontology．org)，KEGG(http：//www．biorcart．com)數(shù)據(jù)庫，獲取肝癌相關(guān)基因信息。 結(jié)

8、果 1．各組總RNA提取結(jié)果良好，總RNA的吸光度OD260/OD280值均在1.8～2.0，熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)顯示70℃h與20℃h電泳條帶比較，28s條帶無明顯降解，mRNA主要集中于0.9～4.0kb的連續(xù)條帶。電泳結(jié)果證實(shí)已抽提高純度的RNA。 2．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全符合Affymetrix U133．Plus 2.0基因芯片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到要求。檢測系統(tǒng)正常，保證雜交結(jié)果的可靠性。 3．以正常肝組織為對(duì)照

9、比較，篩選出肝炎、肝硬化、肝癌差異基因表達(dá)譜。通過對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)分析，篩選出在肝炎、肝硬化、肝癌中共同差異表達(dá)的基因81個(gè)，包括原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、代謝酶類相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)抗原等。有53個(gè)基因持續(xù)上調(diào)表達(dá)，28個(gè)基因持續(xù)下調(diào)表達(dá)；其中已知功能基因66個(gè)，未知功能基因15個(gè)。 結(jié)論1．有多種基因共同參與肝癌發(fā)生的整個(gè)過程。利用基因芯片技術(shù)分析肝癌基因表達(dá)譜變化，能夠快