龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國(guó)著名熱帶亞熱帶特色果樹(shù)。然而，龍眼果實(shí)存在種子大、可食率低，胚胎敗育可導(dǎo)致落果、結(jié)實(shí)率降低等問(wèn)題，影響龍眼的品質(zhì)和產(chǎn)量。龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)為在離體條件下研究龍眼胚胎的發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了一個(gè)有效的模型。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境一直被認(rèn)為是決定細(xì)胞功能的重要因素，氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽（GSSG/2GSH）是用來(lái)指示細(xì)胞整體氧化還原狀態(tài)的最佳指標(biāo)。在體胚誘導(dǎo)過(guò)程中，還原型谷胱甘肽

2、的環(huán)境能夠增加胚胎早期階段未成熟的胚胎的數(shù)量，而氧化型谷胱甘肽環(huán)境保證了胚胎后期的完全發(fā)育和成熟。本研究在龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank登錄號(hào) SRA050205）的基礎(chǔ)上，分析找出與龍眼谷胱甘肽代謝過(guò)程中相關(guān)的酶及其基因；與此同時(shí)，以龍眼胚性愈傷組織為材料，克隆與谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因，并利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)基因在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行分析，初步探究龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中谷胱甘肽代謝的分子機(jī)制，為進(jìn)一步了解龍眼體胚

3、發(fā)生的分子機(jī)制提供新的線索。本研究主要研究結(jié)果如下：
　　1、龍眼胚性愈傷組織中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組（登錄號(hào)SRA050205）的KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示了與谷胱甘肽代謝相關(guān)的5種酶類(lèi)，其中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽還原酶，涉及了谷胱甘肽合成與轉(zhuǎn)化的功能；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶參與了谷胱甘肽的降解過(guò)程。根據(jù)Gene Ontology

4、（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)顯示的基因分類(lèi)和基因功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)共有139個(gè)unigenes在谷胱甘肽代謝的路徑中發(fā)揮重要作用（在GenBank登錄92個(gè)unigenes）。
　　2、龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的克隆
　　以龍眼胚性愈傷組織為材料，采用同源克隆和 RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，克隆得到了龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因γ-ECS、GSHS、GR、GPX、GST的cDNA全長(zhǎng)序列及基因組DNA序列。①γ-ECS基

5、因的GenBank登錄號(hào)為JF815477，全長(zhǎng)1812 bp，編碼一個(gè)含有511個(gè)氨基酸殘基的蛋白，包含一個(gè)17 bp的5′UTR、1541 bp的ORF（18-1535）、254 bp的3′UTR和23 bp的poly（A）尾巴。② GSHS基因的GenBank登錄號(hào)為JF815478，全長(zhǎng)1831 bp，編碼一個(gè)含有478個(gè)氨基酸殘基的蛋白，包含一個(gè)191 bp的5′UTR、1437 bp的ORF（192-1604）、203 bp

6、的3′UTR和24 bp的poly（A）尾巴。GSHS的基因組DNA全長(zhǎng)5624 bp，登錄號(hào)為：JX857867。其中，內(nèi)含子11個(gè)，外顯子12個(gè)，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。第6個(gè)內(nèi)含子屬于AT-AC型，其余內(nèi)含子的剪切方式屬于GT-AG類(lèi)型。③ GR基因的GenBank登錄號(hào)為JF815405，全長(zhǎng)2140 bp，編碼一個(gè)含有533個(gè)氨基酸殘基的蛋白，包含一個(gè)16 bp的5′UTR、1662 bp的ORF（17-1649

7、）、462 bp的3′UTR和29 bp的poly（A）尾巴。GR的基因組DNA全長(zhǎng)4610 bp，登錄號(hào)為：JX315460。其中，內(nèi)含子10個(gè)，外顯子11個(gè)，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。10個(gè)內(nèi)含子的剪切方式都屬于GT-AG類(lèi)型。④ GPX基因的GenBank登錄號(hào)為JF815411.1，全長(zhǎng)746 bp，編碼一個(gè)含有171個(gè)氨基酸殘基的蛋白，包含一個(gè)8 bp的5′UTR、516 bp的ORF（9-502）、222 bp的

8、3′UTR和22 bp的poly（A）尾巴。GPX的基因組DNA全長(zhǎng)1902 bp，登錄號(hào)為：JX123752。其中，內(nèi)含子5個(gè)，外顯子6個(gè)，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。內(nèi)含子的剪切方式都屬于GT-AG類(lèi)型。⑤ GST基因的 GenBank登錄號(hào)為 JF815448，GST全長(zhǎng)900 bp，編碼一個(gè)含有219個(gè)氨基酸殘基的蛋白，包含一個(gè)59 bp的5′ UTR、660 bp的ORF（60-704）、181 bp的3′UTR和1

9、5 bp的poly（A）尾巴。GST的基因組DNA全長(zhǎng)1018 bp，登錄號(hào)為：KC109142。其中，內(nèi)含子2個(gè)，外顯子3個(gè)，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。內(nèi)含子的剪切方式都屬于GT-AG類(lèi)型。
　　3、龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　在獲得龍眼胚性愈傷組織谷胱甘肽代謝相關(guān)基因 cDNA全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)軟件對(duì)各個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框編碼的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如下：①γ

10、-ECS是一個(gè)穩(wěn)定的親水蛋白；不含有信號(hào)肽，是一個(gè)跨膜蛋白，定位于過(guò)氧化物酶體中；含有5種功能位點(diǎn)和豐富的潛在磷酸化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。②GSHS屬于不穩(wěn)定親水蛋白；不含有信號(hào)肽，是一個(gè)跨膜蛋白，定位在細(xì)胞質(zhì)；含有4種功能位點(diǎn)和豐富的潛在磷酸化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主；③ GR屬于不穩(wěn)定親水蛋白；不含有信號(hào)肽，是一個(gè)跨膜蛋白，定位在細(xì)胞質(zhì)；含有5種功能位點(diǎn)和豐富的潛在磷酸化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)

11、構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。④ GPX是一個(gè)穩(wěn)定的親水蛋白；不含有信號(hào)肽，不是跨膜蛋白，定位在細(xì)胞質(zhì)；含有4種功能位點(diǎn)和豐富的潛在磷酸化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主。⑤ GST是一個(gè)穩(wěn)定的親水蛋白；不含有信號(hào)肽，是一個(gè)跨膜蛋白，定位在細(xì)胞質(zhì)；含有4種功能位點(diǎn)和豐富的潛在磷酸化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主。
　　4、龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的定量表達(dá)
　　在獲得龍眼胚性愈傷組織中谷胱甘肽代謝

12、相關(guān)酶基因cDNA全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，采用EF-Ia、eIF-4a、DlFe-SOD基因作為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中各基因在不同發(fā)育階段的差異表達(dá)模式，qPCR結(jié)果顯示：①γ-ECS和GSHS基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢(shì)大致相似。γ-ECS和GSHS基因的表達(dá)量逐漸升高。在心形胚的階段，γ-ECS和GSHS基因的表達(dá)量都達(dá)到最大值。與此同時(shí)，γ-ECS和GSHS基因的在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)量也存

13、在著差異。在相對(duì)表達(dá)量的整體水平上，γ-ECS基因的相對(duì)表達(dá)量要高于GSHS基因的相對(duì)表達(dá)量。② GR基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平先在不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)階段有緩慢的降低，然后在球形胚階段瞬間達(dá)到相對(duì)表達(dá)量的最大值。最后在心形胚、魚(yú)雷形胚和子葉胚階段相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，在子葉胚階段下降到幾乎不表達(dá)的狀態(tài)。③在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中各個(gè)階段，GPX基因都有表達(dá)。在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中，隨著胚性愈傷組織的分化，基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，在魚(yú)雷

14、形胚階段相對(duì)表達(dá)量有小幅的上升之后，在子葉胚階段GPX基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最小值。④ GST基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平隨著胚性愈傷組織的生長(zhǎng)和分化逐漸升高，在球形胚階段達(dá)到相對(duì)表達(dá)量的最大值。然后，隨著體胚的繼續(xù)發(fā)育與成熟，在心形胚階段相對(duì)表達(dá)量迅速下降，在魚(yú)雷形胚階段幾乎不表達(dá)，而在子葉胚階段的相對(duì)表達(dá)量為0。⑤在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中，GR基因和γ-ECS和GSHS基因一起決定了細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量，在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的早