龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的克隆及其表達分析.pdf

1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國著名熱帶亞熱帶特色果樹。然而，龍眼果實存在種子大、可食率低，胚胎敗育可導(dǎo)致落果、結(jié)實率降低等問題，影響龍眼的品質(zhì)和產(chǎn)量。龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)為在離體條件下研究龍眼胚胎的發(fā)育調(diào)控機制提供了一個有效的模型。細胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境一直被認為是決定細胞功能的重要因素，氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽（GSSG/2GSH）是用來指示細胞整體氧化還原狀態(tài)的最佳指標(biāo)。在體胚誘導(dǎo)過程中，還原型谷胱甘肽

2、的環(huán)境能夠增加胚胎早期階段未成熟的胚胎的數(shù)量，而氧化型谷胱甘肽環(huán)境保證了胚胎后期的完全發(fā)育和成熟。本研究在龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號 SRA050205）的基礎(chǔ)上，分析找出與龍眼谷胱甘肽代謝過程中相關(guān)的酶及其基因；與此同時，以龍眼胚性愈傷組織為材料，克隆與谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因，并利用熒光定量PCR技術(shù)對相關(guān)基因在體胚發(fā)生過程中的表達進行分析，初步探究龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝的分子機制，為進一步了解龍眼體胚

3、發(fā)生的分子機制提供新的線索。本研究主要研究結(jié)果如下：
　　1、龍眼胚性愈傷組織中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的全轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組（登錄號SRA050205）的KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中顯示了與谷胱甘肽代謝相關(guān)的5種酶類，其中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽還原酶，涉及了谷胱甘肽合成與轉(zhuǎn)化的功能；谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶參與了谷胱甘肽的降解過程。根據(jù)Gene Ontology

4、（GO）數(shù)據(jù)庫顯示的基因分類和基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)共有139個unigenes在谷胱甘肽代謝的路徑中發(fā)揮重要作用（在GenBank登錄92個unigenes）。
　　2、龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的克隆
　　以龍眼胚性愈傷組織為材料，采用同源克隆和 RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，克隆得到了龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因γ-ECS、GSHS、GR、GPX、GST的cDNA全長序列及基因組DNA序列。①γ-ECS基

5、因的GenBank登錄號為JF815477，全長1812 bp，編碼一個含有511個氨基酸殘基的蛋白，包含一個17 bp的5′UTR、1541 bp的ORF（18-1535）、254 bp的3′UTR和23 bp的poly（A）尾巴。② GSHS基因的GenBank登錄號為JF815478，全長1831 bp，編碼一個含有478個氨基酸殘基的蛋白，包含一個191 bp的5′UTR、1437 bp的ORF（192-1604）、203 bp

6、的3′UTR和24 bp的poly（A）尾巴。GSHS的基因組DNA全長5624 bp，登錄號為：JX857867。其中，內(nèi)含子11個，外顯子12個，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。第6個內(nèi)含子屬于AT-AC型，其余內(nèi)含子的剪切方式屬于GT-AG類型。③ GR基因的GenBank登錄號為JF815405，全長2140 bp，編碼一個含有533個氨基酸殘基的蛋白，包含一個16 bp的5′UTR、1662 bp的ORF（17-1649

7、）、462 bp的3′UTR和29 bp的poly（A）尾巴。GR的基因組DNA全長4610 bp，登錄號為：JX315460。其中，內(nèi)含子10個，外顯子11個，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。10個內(nèi)含子的剪切方式都屬于GT-AG類型。④ GPX基因的GenBank登錄號為JF815411.1，全長746 bp，編碼一個含有171個氨基酸殘基的蛋白，包含一個8 bp的5′UTR、516 bp的ORF（9-502）、222 bp的

8、3′UTR和22 bp的poly（A）尾巴。GPX的基因組DNA全長1902 bp，登錄號為：JX123752。其中，內(nèi)含子5個，外顯子6個，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。內(nèi)含子的剪切方式都屬于GT-AG類型。⑤ GST基因的 GenBank登錄號為 JF815448，GST全長900 bp，編碼一個含有219個氨基酸殘基的蛋白，包含一個59 bp的5′ UTR、660 bp的ORF（60-704）、181 bp的3′UTR和1

9、5 bp的poly（A）尾巴。GST的基因組DNA全長1018 bp，登錄號為：KC109142。其中，內(nèi)含子2個，外顯子3個，外顯子的GC含量高于內(nèi)含子的GC含量。內(nèi)含子的剪切方式都屬于GT-AG類型。
　　3、龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析
　　在獲得龍眼胚性愈傷組織谷胱甘肽代謝相關(guān)基因 cDNA全長的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)軟件對各個基因的開放閱讀框編碼的相應(yīng)氨基酸序列進行預(yù)測分析，結(jié)果如下：①γ

10、-ECS是一個穩(wěn)定的親水蛋白；不含有信號肽，是一個跨膜蛋白，定位于過氧化物酶體中；含有5種功能位點和豐富的潛在磷酸化位點，其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。②GSHS屬于不穩(wěn)定親水蛋白；不含有信號肽，是一個跨膜蛋白，定位在細胞質(zhì)；含有4種功能位點和豐富的潛在磷酸化位點，其二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主；③ GR屬于不穩(wěn)定親水蛋白；不含有信號肽，是一個跨膜蛋白，定位在細胞質(zhì)；含有5種功能位點和豐富的潛在磷酸化位點，其二級結(jié)

11、構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。④ GPX是一個穩(wěn)定的親水蛋白；不含有信號肽，不是跨膜蛋白，定位在細胞質(zhì)；含有4種功能位點和豐富的潛在磷酸化位點，其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主。⑤ GST是一個穩(wěn)定的親水蛋白；不含有信號肽，是一個跨膜蛋白，定位在細胞質(zhì)；含有4種功能位點和豐富的潛在磷酸化位點，其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主。
　　4、龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的定量表達
　　在獲得龍眼胚性愈傷組織中谷胱甘肽代謝

12、相關(guān)酶基因cDNA全長的基礎(chǔ)上，采用EF-Ia、eIF-4a、DlFe-SOD基因作為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過程中各基因在不同發(fā)育階段的差異表達模式，qPCR結(jié)果顯示：①γ-ECS和GSHS基因在龍眼體胚發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢大致相似。γ-ECS和GSHS基因的表達量逐漸升高。在心形胚的階段，γ-ECS和GSHS基因的表達量都達到最大值。與此同時，γ-ECS和GSHS基因的在體胚發(fā)生過程中的表達量也存

13、在著差異。在相對表達量的整體水平上，γ-ECS基因的相對表達量要高于GSHS基因的相對表達量。② GR基因在龍眼體胚發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄水平先在不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)階段有緩慢的降低，然后在球形胚階段瞬間達到相對表達量的最大值。最后在心形胚、魚雷形胚和子葉胚階段相對表達量逐漸下降，在子葉胚階段下降到幾乎不表達的狀態(tài)。③在龍眼體胚發(fā)生過程中各個階段，GPX基因都有表達。在龍眼體胚發(fā)生過程中，隨著胚性愈傷組織的分化，基因的相對表達量逐漸下降，在魚雷

14、形胚階段相對表達量有小幅的上升之后，在子葉胚階段GPX基因的相對表達量達到最小值。④ GST基因在龍眼體胚發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄水平隨著胚性愈傷組織的生長和分化逐漸升高，在球形胚階段達到相對表達量的最大值。然后，隨著體胚的繼續(xù)發(fā)育與成熟，在心形胚階段相對表達量迅速下降，在魚雷形胚階段幾乎不表達，而在子葉胚階段的相對表達量為0。⑤在龍眼體胚發(fā)生過程中，GR基因和γ-ECS和GSHS基因一起決定了細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量，在龍眼體胚發(fā)生過程的早