氯通道在冰片促進(jìn)阿霉素及羅丹明跨血腦屏障中的作用.pdf

1、目的：冰片可以促進(jìn)藥物通過(guò)血腦屏障，但機(jī)制尚不清楚。我們前期研究結(jié)果表明，ClC-3氯通道與物質(zhì)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。氯通道在藥物通過(guò)血腦屏障中是否起作用，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文探討ClC-3氯通道在冰片促進(jìn)阿霉素及羅丹明跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)選用野生型FVB小鼠和ClC-3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因FVB小鼠，雌雄各半，體重為20-30 g。首先建立阿霉素、羅丹明濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的濃度。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定小鼠腦

2、脊液及血清中阿霉素、羅丹明的熒光值。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)分析野生型及ClC-3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片ClC-3表達(dá)及分布。透射電鏡觀測(cè)小鼠腦微小血管圖像的變化。膜片鉗記錄冰片激活的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氯電流?；罴?xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及拍攝細(xì)胞圖像，分析冰片和氯通道阻斷劑tamoxifen、DIDS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞容積的影響。
　　結(jié)果：小鼠腹腔注射阿霉素后，血清中阿霉素顯著高于腦脊液中阿霉素(P<0.01)，表明阿霉素不容易通過(guò)血腦屏障。在

3、冰片灌胃后給予阿霉素，腦脊液中的阿霉素比單純注射阿霉素組顯著增高2.48倍（P<0.01），達(dá)到血清阿霉素組濃度的37.2％，而冰片作用前后，血清中的阿霉素濃度沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。表明冰片有促進(jìn)阿霉素通過(guò)血腦屏障的作用。氯通道阻斷劑tamoxifen及 DIDS作用后，逆轉(zhuǎn)冰片開(kāi)放血腦屏障的作用，腦脊液中的阿霉素濃度明顯降低（P<0.01）。
　　在冰片灌胃后給予羅丹明，腦脊液中的羅丹明濃度明顯增高（P<0.01），比單

4、純注射羅丹明組提高了1.90倍，Tamoxifen及DIDS抑制冰片的作用，腦脊液中的羅丹明濃度明顯降低（P<0.01）。而冰片作用前后，血清中的羅丹明濃度沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。
　　根據(jù)鼠尾基因檢測(cè)結(jié)果，在長(zhǎng)波紫外光下觀察瓊脂糖凝膠上的PCR條帶，在440bp處出現(xiàn)條帶者為陽(yáng)性小鼠即ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠。與野生型小鼠組相比，ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠腦脊液阿霉素、羅丹明顯著升高（P<0.01），提示高表達(dá)ClC-3氯通道可提高

5、血腦屏障通透性，氯通道阻斷劑tamoxifen及DIDS可抑這一作用（P<0.01）。給予ClC-3過(guò)表達(dá)組冰片24h口服比起單純ClC-3組及冰片組顯著提高阿霉素及羅丹明123進(jìn)入腦脊液（P<0.05）。與野生型小組比較，ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠腦脊液阿霉素、羅丹明增加（P<0.05），提示冰片對(duì)ClC-3過(guò)表達(dá)鼠開(kāi)放血腦屏障作用更顯著。
　　免疫組化結(jié)果顯示，ClC-3過(guò)表達(dá)小鼠的腦膜血管大量表達(dá)ClC-3，比野生型組高29%（P

6、<0.01）。透射電鏡觀察到冰片組及ClC-3過(guò)表達(dá)組腦膜血管內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡增多，緊密連接松解。
　　膜片鉗結(jié)果顯示，冰片可以激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞氯電流。在細(xì)胞外灌流等滲溶液時(shí)，細(xì)胞的基礎(chǔ)電流很小。20μmol/L冰片溶液灌流細(xì)胞后，明顯激活一個(gè)氯電流（P<0.01）。外向電流較大（32.65±4.97） pA·pF－1（+80 mV），內(nèi)向電流較?。ǎ?3.90±3.21） pA·pF－1（－80 mV），呈現(xiàn)較明顯的外向

7、優(yōu)勢(shì)，無(wú)時(shí)間及電壓依賴性的失活。該電流具有容積敏感性，被細(xì)胞外高滲液完全抑制。DIDS使冰片激活的外向電流從（28.93±6.32） pA·pF－1下降到（6.63±1.50） pA·pF－1（P<0.01），抑制率為（95.4±3.9）%，DIDS對(duì)內(nèi)、外向電流的抑制率差異無(wú)顯著性。在+80 mV電壓鉗制時(shí)，Tamoxifen使冰片激活的外向電流從（32.10±5.67）pA·pF－1下降到（6.49±1.38）pA·pF－1（P<0

8、.01），抑制率為（94.2±3.8）%，對(duì)內(nèi)、外向電流的抑制率差異無(wú)顯著性。本結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)冰片激活的電流是氯通道介導(dǎo)的氯電流。
　　活細(xì)胞圖像分析顯示，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外灌流20μmol/L冰片溶液60 min，細(xì)胞容積縮?。?2.6±2.1）%（P<0.01），該作用可被氯通道阻斷劑tamoxifen和DIDS明顯抑制（P<0.01），tamoxifen與DIDS的抑制效果間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：<