幾種常見多酚類化合物對低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力保護效應(yīng)及分子機制研究.pdf

1、目的:高原低壓低氧環(huán)境對快速進入高原的人的認知功能，如短時記憶、注意廣度及注意轉(zhuǎn)化能力、思維判斷能力均產(chǎn)生不利影響，進而影響人正常的生活、工作和學(xué)習(xí)。隨著高原地區(qū)經(jīng)濟社會的發(fā)展，進入高原地區(qū)人數(shù)逐年增加，這種影響的危害性越來越顯著。此外，從軍事角度來看，未來戰(zhàn)爭快速推進及跨區(qū)戰(zhàn)略投送呈常態(tài)化，認知功能受損導(dǎo)致的軍事作業(yè)能力下降將極大地削弱戰(zhàn)斗力。目前針對急進高原初期認知功能障礙的防治措施主要有兩類:階梯適應(yīng)性訓(xùn)練和化學(xué)合成藥物（如乙酰唑

2、胺）干預(yù)，適應(yīng)性訓(xùn)練需要特定條件且耗時長，化學(xué)合成藥物干預(yù)的安全有效的作用劑量范圍較窄且難以祛除有害作用。而研究發(fā)現(xiàn)廣泛存在于自然界的植物化學(xué)物有著多種生物化學(xué)功能，能發(fā)揮有效的抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用，且較少產(chǎn)生副作用。因此，開展可減輕急進高原初期認知功能障礙、促進高原認知功能快速適應(yīng)的天然植物化學(xué)物的研究，提供及時的、有效的生物醫(yī)學(xué)解決方案，有著較大的現(xiàn)實意義。
　　記憶能力在諸多認知功能中占重要地位。雖然低壓低氧環(huán)境下機體發(fā)生

3、記憶能力損傷的機制尚不明確，但活性氧產(chǎn)生增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平過高在低壓低氧環(huán)境下記憶能力損傷的發(fā)生中占重要地位，作為活性氧主要產(chǎn)生部位的線粒體和易受氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)元突觸亦參與其中。如何保護低壓低氧環(huán)境下的線粒體和神經(jīng)元突觸是減輕記憶能力損傷的一個重要作用靶點。越來越多的研究證據(jù)顯示，植物化學(xué)物具多種生物化學(xué)功能，其中多酚類化合物更是受到較多關(guān)注和研究，能夠發(fā)揮有效的抗氧化應(yīng)激作用。此外動物實驗發(fā)現(xiàn)多酚類化合物可發(fā)揮對腦缺血再灌注損

4、傷中神經(jīng)元的保護作用，且可改善病理狀況下線粒體的狀態(tài)。低壓低氧導(dǎo)致的機體損傷變化，與缺血再灌注導(dǎo)致的損害改變相類似。基于以上分析，我們推測，以多酚類化合物調(diào)節(jié)神經(jīng)元線粒體穩(wěn)態(tài)及改善神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)來減少低壓低氧環(huán)境下神經(jīng)元的損傷，可能會成為減輕低壓低氧環(huán)境下機體記憶能力損傷的一條有效途徑。
　　本研究擬利用動物實驗和細胞實驗相結(jié)合的方法，從動物和細胞水平研究對低壓低氧環(huán)境下機體認知記憶能力損傷具有保護效應(yīng)的多酚類化合物及其作用機制。

5、在模擬高原低壓低氧環(huán)境中建立大鼠記憶能力損傷模型，并在此動物模型基礎(chǔ)上檢測四種常見多酚類化合物-白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)、槲皮素(Quercetin，QUE)、二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DHM)和楊梅素(Myricetin，MYR)對大鼠記憶能力損傷的作用，發(fā)現(xiàn)QUE和DHM能明顯減輕大鼠記憶能力損傷;圍繞QUE和DHM發(fā)揮作用的靶點和機制，探索了線粒體穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)改變和相關(guān)信號蛋白表達水平

6、在其中發(fā)生的變化，并闡明SIRT3/FOXO3信號通路在DHM保護低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的作用。
　　方法:本研究采用低壓氧艙模擬海拔5000m低壓低氧環(huán)境，雄性SD大鼠暴露于低壓低氧環(huán)境下1、3、7、14d后利用Morris水迷宮檢測不同暴露時長后大鼠空間記憶能力的變化，比較分析后選擇7d為暴露時長建立低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力損傷模型，并以此模型為基礎(chǔ)進行下一步實驗。RSV、QUE、DHM和MYR四種常見多酚類化合物分別以

7、梯度劑量(50、75、100mg/kg.bw/d)灌胃暴露于低壓低氧環(huán)境下的大鼠，7d后利用Morris水迷宮檢測大鼠空間記憶能力的變化，發(fā)現(xiàn)100mg//kg.bw/d劑量的QUE(QUE100)和100mg/kg.bw/d劑量的DHM(DHM100)對低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力具有顯著的保護作用。
　　結(jié)果:1.大鼠分別暴露于模擬海拔5000m低壓低氧環(huán)境中1、3、7、14d，Morris水迷宮檢測大鼠空間記憶能力后發(fā)現(xiàn)與常氧

8、對照組大鼠相比，7d和14d的暴露使得大鼠空間記憶能力顯著下降;且暴露14d后大鼠空間記憶能力下降程度與暴露7d后的大鼠相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。因此選擇7d作為建立低壓低氧下大鼠記憶損傷模型的暴露時長。
　　2.大鼠暴露于低壓低氧環(huán)境下時(7d)，四種多酚類化合物:RSV、QUE、DHM和MYR分別以梯度劑量(50、75、100mg/kg.bw/day)灌胃干預(yù)大鼠7d，并在低壓低氧暴露結(jié)束后利用Morris水迷宮檢測大鼠空間記憶能力

9、，發(fā)現(xiàn)與低氧對照組相比，QUE100和DHM100均可明顯減輕大鼠的記憶能力損傷。而Morris水迷宮測試沒有觀察到RSV和MYR各劑量干預(yù)組大鼠記憶能力損傷與低氧對照組大鼠相比有明顯減輕。
　　3.TEM觀測結(jié)果顯示QUE100和DHM100均能顯著改善低壓低氧導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元中線粒體結(jié)構(gòu)異常和突觸后致密物減少;Qrt-PCR結(jié)果顯示，與低氧對照組相比，QUE100和DHM100均使大鼠海馬神經(jīng)元線粒體DNA相對拷貝數(shù)明顯增加;

10、基于酶聯(lián)免疫技術(shù)的微孔板檢測發(fā)現(xiàn)，與低氧對照組相比，QUE100大鼠海馬組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性明顯升高，DHM100干預(yù)組大鼠海馬組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性顯著升高;蛋白免疫印跡實驗表明，QUE100干預(yù)組大鼠海馬組織PGC-1α、SIRT1蛋白、線粒體生成相關(guān)蛋白Nrf1、TFAM及線粒體融合相關(guān)蛋白Mfn1、Mfn2表達水平顯著高于低氧對照組，而QUE100大鼠海馬組織線粒體分裂相關(guān)蛋白Fis1、Dr

11、p1表達水平顯著低于低氧對照組;此外QUE100大鼠海馬組織神經(jīng)生長因子BDNF和FNDC5蛋白表達水平明顯高于低氧對照組。脂質(zhì)過氧化物水平檢測顯示DHM100干預(yù)組大鼠海馬組織MDA水平顯著低于低氧對照組。蛋白免疫印跡實驗表明，DHM100干預(yù)組大鼠海馬組織SIRT3蛋白表達水平明顯高于低氧對照組，而FOXO3乙?；矫黠@低于低氧對照組。此外，DHM100干預(yù)組大鼠海馬神經(jīng)元線粒體生成相關(guān)蛋白PGC-1α、TFAM和神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋

12、白SYP、PSD95表達水平顯著高于低氧對照組。
　　4.低氧環(huán)境下培養(yǎng)HT-22細胞，發(fā)現(xiàn)DHM干預(yù)減輕了低氧導(dǎo)致的HT-22細胞線粒體DNA相對拷貝數(shù)下降，增強了HT-22細胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性并增加了HT-22細胞ATP水平，降低了HT-22細胞脂質(zhì)過氧化水平、細胞內(nèi)活性氧水平和線粒體超氧化物水平，能上調(diào)SIRT3蛋白表達水平，同時降低FOXO3乙?；?，可上調(diào)線粒體生成相關(guān)蛋白PGC-1α、TFAM和突觸

13、相關(guān)蛋白SYP、PSD95表達水平。采用SIRT3 siRNA轉(zhuǎn)染HT-22細胞沉默SIRT3蛋白表達后，沒有觀察到DHM對低氧環(huán)境下培養(yǎng)的HT-22細胞的FOXO3乙?；降挠绊?。采用SIRT3 siRNA或FOXO3 siRNA轉(zhuǎn)染HT-22細胞沉默SIRT3或FOXO3蛋白表達后，沒有觀察到DHM對低氧環(huán)境下培養(yǎng)的HT-22細胞線粒體DNA的相對拷貝數(shù)、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性、HT-22細胞ATP水平、HT-22細胞

14、脂質(zhì)過氧化水平、細胞內(nèi)活性氧水平和線粒體超氧化物水平及線粒體生成相關(guān)蛋白PGC-1α、TFAM和突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD95表達水平的顯著影響。
　　結(jié)論:1.成功建立模擬高原低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力損傷模型，發(fā)現(xiàn)在模擬海拔5000m低壓低氧環(huán)境下暴露7d后大鼠空間記憶能力受到明顯損傷。
　　2.比較研究四種常見多酚類化合物對低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的保護效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)QUE和DHM均可明顯減輕低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的

15、損傷，而RSV和MYR對低壓低氧環(huán)境下大鼠記憶能力的損傷無顯著性保護作用。
　　3.QUE和DHM均可以有效改善低壓低氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元線粒體生成、結(jié)構(gòu)和功能，并能顯著減輕海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)損傷。
　　4.QUE能有效調(diào)節(jié)低壓低氧環(huán)境下大鼠海馬神經(jīng)元線粒體的融合分裂相關(guān)蛋白表達水平并能促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF表達水平。SIRT1/PGC-1α/Nrf1/Tfam通路參與了QUE對線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用，PGC-1α/

16、FNDC5/BDNF參與了QUE對神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的保護作用。
　　5.利用HT-22細胞低氧損傷模型和siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，發(fā)現(xiàn)DHM可通過SIRT3去乙?；疐OXO3進而調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)，包括有效改善線粒體生成、結(jié)構(gòu)和功能，同時顯著降低線粒體超氧化物水平、細胞內(nèi)活性氧水平和氧化應(yīng)激水平，保護突觸結(jié)構(gòu)，進而發(fā)揮保護神經(jīng)元功能的作用。
　　綜上所述，本課題研究了四種常見多酚類化合物對急進高原初期機體記憶能力損傷的保護適應(yīng)及其分子機