乙肝病毒復(fù)制水平、基因變異與母嬰傳播宮內(nèi)感染關(guān)系的研究.pdf

1、目的:通過對乙型肝炎母嬰患者進(jìn)行血清學(xué)、基因?qū)W檢測及流行病學(xué)調(diào)查，探討乙型肝炎病毒(HBV)血清標(biāo)志物、HBV-DNA含量及基因變異與母嬰傳播宮內(nèi)感染的關(guān)系，從而指導(dǎo)臨床對HBV母嬰傳播進(jìn)行有效的阻斷。
　　方法:
　　1、按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)在石家莊市第六醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收集乙肝孕婦共374例，簽署知情同意書，收集相關(guān)資料，填寫調(diào)查情況表;
　　2、采集上述入選孕婦靜脈血及其新生兒24h內(nèi)靜脈血或臍帶血，分離血

2、清進(jìn)行相應(yīng)血清學(xué)及HBV-DNA定量檢測后，-20℃凍存。并對幼兒于出生后1月、6月和1年各采血一次，同樣的程序處理;
　　3、標(biāo)本在冷凍條件下分批送至河北省疾病預(yù)防控制中心-80℃凍存，復(fù)查血清學(xué)及HBV-DNA定量檢測;
　　4、參考NCBI上已知的HBV全基因及各片段的基因序列，查找相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)并合成特異性的擴(kuò)增引物和測序引物;
　　5、采用SPSS19.0軟件對標(biāo)本血清學(xué)及HBV-DNA定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3、，選取試驗(yàn)組和對照組。計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　6分組提取HBV-DNA，PCR擴(kuò)增后測序;
　　7測序結(jié)果用DNAStar軟件拼接后，分析HBV核苷酸和氨基酸的同源性，并對其基因變異特征進(jìn)行分析討論。
　　結(jié)果:
　　1、乙肝孕婦374例中HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性患者占48.66％(182/374)，HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性患者占

4、39.57％(148/374)，其余型別共11.77％(44/374); HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性患者HBV-DNA檢出率為92.8％(169/182)，HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性患者HBV-DNA檢出率為47.3％(70/148)，兩組患者1gHBV-DNA均數(shù)分別為7.26±1.56copies/ml、4.89±0.95copies/ml。兩組HBV-DNA陽性檢出率比較，組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=84

5、.83，P＜0.01)。兩組HBV-DNA含量對數(shù)值比較，P＜0.01，組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　375例新生兒出生24h內(nèi)HBsAg陽性檢出率為7.47％(28/375)，HBV-DNA陽性率為2.40％(9/375)，其中6例新生兒HBsAg和HBV-DNA均為陽性，最后得出新生兒出生24h內(nèi)HBV感染數(shù)為31例，感染率為8.27％(31/375)，并且其母親均為HBsAg、 HBeAg、 HBcAb陽性患者;幼兒出生1月

6、后復(fù)查外周血HBV標(biāo)志物以及HBV-DNA，其中HBsAg陽性率為4.00％(15/375)，HBV-DNA陽性率為1.07％(4/375)，其中2例幼兒HBsAg和HBV-DNA均為陽性，得出幼兒出生1月后HBV感染數(shù)為17例，感染率為4.53％(17/375);因此，新生兒出生24h內(nèi)與幼兒出生1月后感染率進(jìn)行比較，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.36，P＜0.05)。幼兒出生6月后復(fù)查外周血HBsAg和HBV-DNA陽性率分別為3

7、.73％(14/375)、1.07％(4/375);幼兒出生1年后復(fù)查結(jié)果與出生6月后無差別。
　　2、HBVS基因核苷酸同源性比較結(jié)果顯示，編號A68、A7、A7B0與參考序列AF100309的同源性分別為99.7％、99.3％、99.3％，屬于B基因型，試驗(yàn)中其他標(biāo)本與AF286594同源性均大于98.5％，屬于同一基因型C型;另外，母親與新生兒出生24h比較，A7與A7B0、A41與A41B0、A31與A31B0、A72與A

8、72B0、A90與A90B0、A135與A135B0的同源性分別為100％、98.2％、100％、99.9％、99.8％、99.9％，幼兒出生后1月與6月甚至1年，基因也均無明顯變化，同源性很高。常見的基因變異有:A7與A7B0共同變異345G→A、793G→A、796G→T、799G→A，A41B0、a89、A106共同變異783G→A、592C→T，A41 B0與A198共同變異508G→A，A31、A198、A219共同變異499

9、T→C，A41與A41B0共同變異289A→T，A41基因變異302G→A、241A→G、320C→G，A68基因變異482A→G、724C→T，A41B0基因變異438T→C、776A→C、759G→C，引起相應(yīng)的氨基酸變異有:A7與A7B0共同變異Y64C、I213M，A41 B0與a89、A106共同變異N210S，A41氨基酸變異S50G，A68氨基酸變異V110I，A41 B0氨基酸變異S95L、L208I、A202G。

10、>　　3、所有標(biāo)本Pre-S基因核苷酸同源性比較結(jié)果均在96％以上，常見的變異有:A41、A31、A135、A72共同變異2860G→A引起氨基酸變異Q4K，A7、A7B0共同變異3061C→T引起氨基酸變異P72L，A7、A41、A41B0共同變異3081T→G引起氨基酸變異G79W，還有很多突變?nèi)鏏7基因變異3059T→A，A41B0基因變異3062A→C，A7、A7B0基因變異3092G→A未引起氨基酸變異。幼兒出生后1月與6月甚

11、至1年，基因均無變化。
　　4、HBVX區(qū)相同基因型標(biāo)本之間核苷酸同源性均在96％以上，常見的變異有:A135基因變異2143A→G，A173、A226共同變異2146C→T，A31、A135共同變異2167A→G，A7、A222、A226共同變異2182G→T，A31、A72、A173、A198、A219共同變異2198T→C，均未引起氨基酸的變異。幼兒出生后1月與6月甚至1年，基因均無變化。
　　5、所有標(biāo)本HBV C區(qū)

12、核苷酸同源性比較結(jié)果均在96％以上。基因變異有:1915G→A，1936T→C，2011G→A，3205T→C，但是引起相應(yīng)的氨基酸變化僅有一個(gè)D61Y。幼兒出生后1月與6月甚至1年，基因均無變化。
　　6、HBVP區(qū)相同基因型標(biāo)本之間核苷酸同源性均在96％以上。P區(qū)基因變異除去與S區(qū)基因重疊部分外，仍有變異:A106、A198、A219共同變異855T→A引起氨基酸變異M573L，A106、a129共同變異876 C→T引起氨基

13、酸變異Y579I，A41、A41B0、A90共同變異1092 C→T引起氨基酸變異Y651H，以及未引起氨基酸變異的突變A41、A41B0、A90共同變異1479C A，A41、A41B0共同變異1497 T→G。幼兒出生后1月與6月甚至1年，基因均無變化。
　　結(jié)論:
　　1、HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性孕婦患者HBV-DNA陽性檢出率明顯高于HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性和其他患者;孕婦體內(nèi)HBV-DN

14、A含量的高水平表達(dá)會(huì)增加母嬰傳播宮內(nèi)感染的機(jī)率。
　　2、新生兒出生24h內(nèi)的血清HBsAg和HBV-DNA攜帶情況，不能作為判斷母嬰傳播宮內(nèi)感染的標(biāo)準(zhǔn)。
　　3、HBVS基因中302G→A、345G→A引起的氨基酸變異S50G、Y64C，可能是導(dǎo)致母嬰傳播宮內(nèi)感染的原因。
　　4、Pre-S、X、C、P基因片段在母嬰傳播宮內(nèi)感染標(biāo)本和對照組中均有突變出現(xiàn)，其突變意義還不能確定，仍需做進(jìn)一步的研究。
　　5、除編