乙肝病毒X基因變異對AR在乙肝致癌過程中作用的影響.pdf

1、研究目的：
　　構建穩(wěn)定表達人AR的HepG2細胞系，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、HBx野生型質(zhì)粒和變異型質(zhì)粒至HepG2細胞，通過檢測細胞的遷移力、增殖周期和細胞凋亡等，探究HCC相關HBx變異與AR的交互作用對肝癌惡性程度的影響。
　　研究方法：
　　1.構建攜帶人AR外顯子基因、綠色熒光蛋白基因(GFP)及嘌呤霉素基因(PM)的重組表達質(zhì)粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro);2.重組表達質(zhì)粒包裝感染Hep

2、G2細胞及嘌呤霉素加壓篩選，構建能穩(wěn)定表達人AR的HepG2細胞系;3.分別以慢病毒空載體、攜帶HBx野生型全長基因的慢病毒載體以及攜帶A1727G+A1762T/G1764組合突變或3'端缺失突變的HBx基因的慢病毒載體，瞬時轉(zhuǎn)染HepG2-GFP-AR細胞，通過細胞遷移實驗和流式細胞技術檢測細胞周期和細胞凋亡，觀察不同HBx與AR在乙肝相關性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功構建了攜帶人AR基因的慢病毒表達

3、載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-AR。2.通過攜帶AR基因的慢病毒感染HepG2細胞，篩選出穩(wěn)定高表達人AR的HepG2細胞株，經(jīng)流式細胞術驗證其GFP的表達量，傳至第10代后，該細胞株GFP的表達量為97.7％; Western-blot實驗鑒定單克隆細胞株傳至第14代時AR的表達量，2號克隆AR的表達量較高。3.選取AR表達量較高的2號克隆用于后續(xù)功能實驗，Transwell實驗結(jié)果顯示:HBx空轉(zhuǎn)染組在加入

4、DHT后，下室中細胞OD值（0.45±0.02）顯著高于未加DHT組(0.33±0.03)，p＜0.001;與未轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2-GFP-AR細胞（空-組）(0.33±0.03)比較，轉(zhuǎn)染攜帶HBxA1727G+A1762T/G1764組合突變(167-組)(0.43±0.01，p=0.001)或3'端缺失突變(CT-組)(0.45±0.03，p＜0.001)的質(zhì)粒后，下室中細胞OD值顯著增高;HepG2-GFP-AR細胞在分

5、別轉(zhuǎn)染HBx A1727G+A1762T/G1764組合突變（167-組）或3'端缺失突變（CT-組）的質(zhì)粒后，加入DHT時，下室中細胞OD值顯著降低（167-組 vs167+組，0.43±0.01 vs0.36±0.02，p=0.009; CT-組vs CT+組，0.45±0.03 vs0.35±0.04，p=0.001)。細胞周期實驗結(jié)果顯示:各組間G2+S期細胞總占比無顯著統(tǒng)計學差異。細胞凋亡實驗結(jié)果顯示:各組間細胞總凋亡率無顯著

6、統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗成功構建了攜帶人AR外顯子基因的慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-AR;并利用該載體，慢病毒感染HepG2細胞，成功構建了穩(wěn)定表達AR的HepG2細胞系HepG2-GFP-AR。
　　2.通過AR高表達細胞系HepG2-GFP-AR進一步功能實驗，發(fā)現(xiàn)在高表達AR的HepG2-GFP-AR細胞中，轉(zhuǎn)染空載體組加入DHT后細胞遷移能力顯著增強，而轉(zhuǎn)染