結(jié)腸癌相關(guān)生物標(biāo)記物的驗(yàn)證及功能研究.pdf

1、目的：課題組前期工作建立結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選腫瘤相關(guān)基因。SCRN1和BRG1為數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的結(jié)腸癌相關(guān)基因。本研究探索SCRN1和BRG1在結(jié)腸癌進(jìn)展中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1．應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO和HCT116中SCRN1表達(dá)。在干擾前后的細(xì)胞株中，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP

2、-2和MMP-9含量。
　　2．Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中BRG1 mRNA和蛋白表達(dá)差異（n=40）；結(jié)腸癌組織芯片（n=191）結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌樣本中 BRG1蛋白表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。構(gòu)建BRG1表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞株，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究 BRG1表達(dá)下調(diào)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。
　　結(jié)果：
　　1．結(jié)腸癌細(xì)胞中 S

3、CNR1表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞增殖能力顯著降低（RKO，P<0.001;HCT116，P<0.001）；克隆形成顯著減少（RKO，P<0.01;HCT116，P<0.01）；Transwell實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著減少（RKO，P<0.01; HCT116，P<0.01）；細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2含量（RKO，P<0.001;HCT116，P=0.005）和 MMP-9含量（RKO，P=0.001;HCT116，P=0.037）顯著降低。

4、>　　2．40例配對(duì)的結(jié)腸癌和正常癌旁組織中，36例結(jié)腸癌組織中的BRG1 mRNA表達(dá)水平較其配對(duì)的正常粘膜組織增高，占總數(shù)的90%。免疫組織化學(xué)染色顯示BRG1主要在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞呈棕黃色。BRG1表達(dá)增高與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（P>0.05）；而與結(jié)腸癌患者的腫瘤浸潤(rùn)深度（P<0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P<0.001）、AJCC分期（P<0.001）、分化程度（P

5、=0.017）、脈管侵犯（P=0.042）顯著相關(guān)。BRG1表達(dá)呈中等強(qiáng)度陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性的患者術(shù)后總生存期較短（P<0.001），且更易復(fù)發(fā)（P=0.001）。BRG1表達(dá)下調(diào)后，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性顯著減弱（DLD1，P<0.001;HCT116，P<0.001）；克隆形成顯著減少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）;Transwell實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著減少（DLD1，P<0.01;HCT116，P<0.01）。BR

6、G1表達(dá)下調(diào)后，DLD1細(xì)胞株在裸鼠皮下形成的腫瘤重量較陰性對(duì)照組顯著減?。≒<0.01）。結(jié)論：SCRN1和BRG1參與結(jié)腸癌進(jìn)展，為潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
　　第二部分 BRG1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究
　　目的：課題組前期工作建立結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)BRG1為結(jié)腸癌相關(guān)基因，本研究探究BRG1在結(jié)腸癌患者中的臨床意義，及其在結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　方法：Real-time PCR檢測(cè)4

7、0對(duì)結(jié)腸癌組織和配對(duì)的正常結(jié)腸粘膜中BRG1 mRNA表達(dá)水平，并通過(guò)Western blot驗(yàn)證BRG1的蛋白表達(dá)水平，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)組織芯片中191例結(jié)腸癌樣本BRG1表達(dá)的情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析BRG1表達(dá)同患者臨床病理信息的相關(guān)性，利用Kaplan-Meier和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)腸癌中BRG1表達(dá)差異同患者術(shù)后生存情況的關(guān)聯(lián)。通過(guò)慢病毒干擾，構(gòu)建BRG1表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞株，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探究 BRG1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞

8、增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．Real-time PCR結(jié)果顯示：36對(duì)樣本出現(xiàn)BRG1表達(dá)增高，占90%（36/40），其中有26例增高達(dá)2倍以上，占65%（26/40）；Western blot結(jié)果顯示，在大部分結(jié)腸癌組織中BRG1蛋白水平高于對(duì)應(yīng)的正常結(jié)腸粘膜組織。
　　2．免疫組化結(jié)果顯示：BRG1主要在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞呈棕黃色。191例結(jié)腸癌組織中，多數(shù)BRG1表達(dá)

9、高于其對(duì)應(yīng)的正常粘膜組織；且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BRG1表達(dá)增高同結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位無(wú)明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05），但與腫瘤浸潤(rùn)程度（P=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P<0.001）、AJCC分期（P<0.001）、分化程度（P=0.017）及脈管侵犯（P=0.042）顯著相關(guān)。
　　3．Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示BRG1高表達(dá)的患者術(shù)后總生存期及無(wú)瘤生存期較BRG1低表達(dá)的患者顯

10、著縮短（P<0.001，P=0.001）；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型提示BRG1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后有關(guān)，但不是獨(dú)立影響因素。
　　4．構(gòu)建針對(duì) BRG1的慢病毒干擾載體，下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中 BRG1的表達(dá)，Real-time PCR及Western blot驗(yàn)證BRG1基因的敲減效率達(dá)70%以上。
　　5．在 BRG1表達(dá)下調(diào)后，CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)提示結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制（DLD1，P<0.001;HCT116，P<0.00