結(jié)腸癌中CacyBP-SIP核轉(zhuǎn)位后相關(guān)信號(hào)通路差異表達(dá)基因的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、目的：結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，但目前對結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。鈣周期素結(jié)合蛋白（Calcyclin-binding protein，CacyBP/SIP）主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素刺激結(jié)腸癌細(xì)胞觀察到CacyBP/SIP具有核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，且促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。本研究以期進(jìn)一步篩選CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后下游相關(guān)信號(hào)通路差表達(dá)基因并驗(yàn)證，探究其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用，為探索CacyBP/SIP入核后下

2、游結(jié)合分子的信號(hào)通路提供研究方向。
　　方法：選用慢病毒包裝的含目的基因CBP-SBP-CacyBP-3X Nuclear targeting sequences病毒上清液感染的SW480結(jié)腸癌細(xì)胞；采用細(xì)胞周期PCR芯片和泛素化途徑信號(hào)通路PCR芯片篩選出差異表達(dá)基因；采用胃泌素刺激CacyBP/SIP進(jìn)入細(xì)胞核，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡(Western Blot)驗(yàn)證五個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)大于2的基因進(jìn)行

3、核酸和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.蛋白免疫印跡驗(yàn)證慢病毒包裝含目的基因CacyBP/SIP由CBP標(biāo)簽帶核定位信號(hào)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞胞核中CacyBP/SIP蛋白穩(wěn)定高表達(dá)。2.細(xì)胞周期和泛素化途徑信號(hào)通路PCR芯片共168個(gè)基因。其中細(xì)胞周期PCR芯片有84個(gè)基因，其中有72個(gè)分子個(gè)表達(dá)上調(diào),12個(gè)分子表達(dá)下調(diào)。泛素（泛素化）PCR芯片共84個(gè)基因，其中有66個(gè)分子表達(dá)上調(diào)，18個(gè)分子表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)倍數(shù)大于2的基

4、因有5個(gè)：CASP3,BRCA2,CKS2,CDK8表達(dá)上調(diào)，PARK2表達(dá)下調(diào)。3.10-7mol/L胃泌素刺激SW480細(xì)胞48h成功制備了CacyBP/SIP入核的細(xì)胞模型。4.qRT-PCR驗(yàn)證5個(gè)差異基因其差異CASP3，BRCA2，CKS2，和CDK8表達(dá)上調(diào)，差異表達(dá)倍數(shù)為：BRCA2為1.92，CDK8為2.38；CKS2為2.25；CASP3為1.82，PARK2表達(dá)下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)為0.133。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BRCA2