肝X受體β促進大腦背側(cè)皮質(zhì)內(nèi)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的作用研究.pdf

1、少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocytes,OLs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)的髓鞘形成細(xì)胞,能夠包繞軸突形成髓鞘介導(dǎo)神經(jīng)元信息快速傳導(dǎo)。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyteprecursorcells,OPCs)進一步分化成熟而來。來源于胚胎腹側(cè)最早分化形成的OPCs在生后逐漸退化消失,背側(cè)皮質(zhì)產(chǎn)生的OPCs在生后仍持續(xù)產(chǎn)生OLs并參與髓鞘形成。然而背側(cè)皮質(zhì)O

2、PCs的產(chǎn)生途徑目前仍不明確。
　　放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(Radialglialcells,RGCs)源于胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)上皮,在大腦皮層發(fā)育早期主要作為神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元,皮層發(fā)育中晚期則提供放射狀纖維引導(dǎo)神經(jīng)元的遷移并參與皮層的板層構(gòu)筑。隨著皮層發(fā)育和神經(jīng)元遷移進程的減慢,RGCs由具有極性特征的雙極細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓男切文z質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞。近年研究顯示RGCs的長纖維結(jié)構(gòu)對髓鞘的形成具有重要調(diào)節(jié)作用;并且RGCs可能是背

3、側(cè)皮質(zhì)OPCs產(chǎn)生的重要途徑。目前關(guān)于大腦背側(cè)皮質(zhì)內(nèi)RGCs向OPCs分化的調(diào)控途徑仍不明確。
　　肝X受體(LiverXreceptors,LXRs)屬于配體激活的核受體超家族成員,包括α與β兩個亞型,是體內(nèi)調(diào)節(jié)膽固醇代謝的重要核受體。對兩型受體的表達(dá)模式分析表明:LXRα主要表達(dá)在脂代謝旺盛的組織與細(xì)胞如肝臟、脂肪組織、小腸等;而LXRβ則在全身具有廣泛性表達(dá),并在CNS證實LXRβ在大腦皮層的表達(dá)呈明顯的發(fā)育學(xué)表達(dá)調(diào)控模式。

4、
　　在大腦皮層的發(fā)育過程中已經(jīng)證實:LXRβ通過影響胚胎晚期皮層新生神經(jīng)元的放射狀遷移而影響大腦皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的形成,并且這一作用與LXRβ參與RGCs長突起形態(tài)的維持密切相關(guān)。在大腦皮質(zhì)與小腦皮質(zhì)中注意到:LXRβ缺失引起RGCs的長纖維顯著減少,并提前轉(zhuǎn)化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞。既往研究顯示:LXRαβ雙敲成年小鼠存在嚴(yán)重的髓鞘形成障礙,并且LXRαβ雙敲小鼠實驗變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimentalautoimmuneenc

5、ephalomyelitis,EAE)模型導(dǎo)致的脫髓鞘病變較野生型(WildType,WT))EAE模型顯著加重,提示LXRβ作為調(diào)控RGCs維持與轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控分子,可能影響RGCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞或OPCs的分化,并進而影響成年CNS的髓鞘形成。
　　本課題首先采用免疫組織化學(xué)檢測LXRβ在胼胝體及室下區(qū)的發(fā)育學(xué)表達(dá),明確LXRβ與白質(zhì)發(fā)育的相關(guān)性。采用曠場實驗(Open-field)檢測6周及3月齡雄性WT和LXRβ敲除(LX

6、Rβknockout,LXRβKO)小鼠的自主活動能力;采用透射電鏡技術(shù)觀察6周及3月齡雄性WT和LXRβ敲除小鼠視神經(jīng)及胼胝體的髓鞘結(jié)構(gòu)。運用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測6周齡雄性WT和LXRβ敲除小鼠胼胝體處成熟OLs的標(biāo)志物CC1的表達(dá)差異,檢測P10、P14、P6W髓鞘堿性蛋白(Myelinbasicprotein,MBP)在WT和LXRβ敲除小鼠胼胝體及皮層內(nèi)的表達(dá),結(jié)合蛋白免疫印跡(Westernblot,WB)進行半定量分析以明確

7、LXRβ與OLs成熟及髓鞘形成的相關(guān)性。同時采用免疫組化與WB比較在P2、P7、P10及P14時WT和LXRβ敲除小鼠背側(cè)皮質(zhì)及胼胝體內(nèi)血小板衍生生長因子受體α(Platelet-derivedgrowthfactorreceptor-α,PDGFRα)及少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(Oligodendrocytelineagetranscriptionfactor2,Olig2)的表達(dá)差異,以明確LXRβ對皮質(zhì)內(nèi)OPCs產(chǎn)生及分化調(diào)節(jié)。采用

8、RGCs的標(biāo)志物腦脂質(zhì)結(jié)合蛋白(Brainlipidbindingprotein,BLBP)與PDGFRα或Olig2進行免疫熒光雙標(biāo),比較P2與P7時WT和LXRβ敲除小鼠背側(cè)皮質(zhì)及胼胝體內(nèi)雙標(biāo)細(xì)胞的表達(dá)差異,以明確LXRβ對RGCs產(chǎn)生OPCs的調(diào)節(jié)。研究顯示,酒精暴露可能會引起腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,導(dǎo)致CNS發(fā)育障礙,進而導(dǎo)致髓鞘形成異常。本課題采用LXRs激動劑TO901317在酒精暴露之前進行預(yù)處理,檢測內(nèi)源性L

9、XRβ活化后對髓鞘的保護作用。
　　主要結(jié)果如下:
　　1、LXRβ在P2,P7,P10,P14,P6W小鼠室下區(qū)及胼胝體中均有持續(xù)性的大量表達(dá)。
　　2、曠場實驗結(jié)果顯示:與同齡C57WT小鼠相比,6周齡的LXRβKO小鼠在10分鐘內(nèi)運動的總路程明顯降低(P<0.01)、中央?yún)^(qū)域活動的路程與時間無明顯差異;3月齡的LXRβ敲除小鼠在10分鐘運動的總路程與WT小鼠比較亦明顯降低(P<0.05)。
　　3、電鏡結(jié)果

10、顯示:與同齡C57WT小鼠相比,6周齡的LXRβKO小鼠視神經(jīng)與胼胝體中的髓鞘明顯減少,并且髓鞘較WT小鼠薄,有較多的脫髓鞘現(xiàn)象;在3月齡的LXRβ敲除小鼠視神經(jīng)與胼胝體中脫髓鞘現(xiàn)象更為顯著。
　　4、6周齡LXRβ敲除小鼠背側(cè)皮質(zhì)與胼胝體中MBP的表達(dá)較同齡野生小鼠相比顯著降低,胼胝體中CC1的表達(dá)也明顯降低。免疫組化結(jié)合WB檢測顯示在P10、P14與P6W時,LXRβ敲除小鼠皮質(zhì)內(nèi)MBP較WT小鼠明顯減少(P<0.05)。

11、r>　　5、P7,P10,P14時,OPCs的標(biāo)志物PDGFR-α及影響促進OPCs形成并進一步發(fā)育分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Olig2在LXRβ敲除小鼠胼胝體處的表達(dá)量顯著低于同齡WT小鼠。同時,WB證實,P7,P10,P14時,PDGFRα,Olig2蛋白在LXRβ敲除小鼠中的表達(dá)量明顯低于同齡WT小鼠。P2時胼胝體處Olig2與PDGFRα雙標(biāo)細(xì)胞在野生小鼠顯著多于LXRβ敲除小鼠。
　　6、P2時WT野生小鼠室下區(qū)、胼胝體區(qū)可見大

12、量BLBP標(biāo)記的RGCs同時表達(dá)OPCs的標(biāo)記物PDGFRα及Olig2,LXRβ缺失導(dǎo)致雙標(biāo)細(xì)胞顯著減少;而在P7野生小鼠與LXRβ敲除小鼠室下區(qū)及胼胝體區(qū)雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)均顯著減少。
　　7、制作酒精誘導(dǎo)的髓鞘損傷模型,加入LXRs激動劑進行保護后,星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Tomato-lectin的表達(dá)量明顯降低(P<0.01),而OPCs的標(biāo)志物PDGFRα的表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。
　　結(jié)論: