1,25(OH)2D3促進NSCs向少突膠質細胞分化及對分化細胞保護作用的實驗研究.pdf

1、第一部分1,25(OH)2D3對促進NSCs增殖和向少突膠質細胞分化作用的實驗研究
　　目的：（1）建立新生SD大鼠神經干細胞系，探討不同濃度的1,25(OH)2D3對NSCs增殖的影響；（2）探討1,25(OH)2D3對NSCs向少突膠質細胞分化的促進作用及最佳濃度。方法：（1）取新生SD大鼠大腦皮層，用無血清培養(yǎng)技術連續(xù)傳代4次后行熒光鑒定，取第5代的NSCs處理成單細胞懸液，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基將細胞濃度調整為5.

2、03105/ml后分成7個實驗組，轉移到24孔板上，每組6個孔，每孔500微升。A組：正常對照組（Normal control），僅含 DMEM/F12完全培養(yǎng)基；B組：溶媒對照組（ Vehicle control），含0.1％無水乙醇的DMEM/F12完全培養(yǎng)基；C組：溶媒對照組（Vehicle control），含1%無水乙醇的DMEM/F12完全培養(yǎng)基；D、E、F、G組：依次為含濃度10-8、10-7、10-6和10-5mol/l

3、1,25(OH)2D3的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。各組均在常規(guī)條件下培養(yǎng)七天，七天后將24孔板內的細胞球在光學顯微鏡下觀察后按分組經離心、機械吹打將神經干細胞處理成單細胞懸液并更換完全培養(yǎng)基，每孔取一滴行臺盼藍染色計數活細胞數并統計學分析各組細胞增殖情況，然后加入抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1：50）行BrdU標記，統計陽性細胞率，統計學分析各組標記細胞數。（2）取第5代的NSCs處理成單細胞懸液，加入DMEM/HIGH GLUCOS

4、E基礎培養(yǎng)基將細胞濃度調整為5.03105/ml后轉移到6孔板上，分成6個實驗組，每組6個孔，每孔2毫升。A組：胎牛血清對照組（Normal control），含10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE基礎培養(yǎng)基；B組：溶媒對照組（Vehicle control），含0.1%無水乙醇及10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE基礎培養(yǎng)基；C、D、E組：依次為含濃度10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2

5、D3的DMEM/HIGH GLUCOSE基礎培養(yǎng)基。以上各組均在相同適宜的條件下誘導分化7天。7天后分別以一抗（兔抗大鼠Gal單克隆抗體，1:100）、二抗（山羊抗兔 IgG-FITC，1:100）染色處理并吹打重懸細胞分別轉入測試管，流式細胞儀收集細胞分析10000個細胞，以陽性細胞數表示少突膠質細胞數量，陰性細胞數表示其他細胞數量。確定陽性細胞比例最高組后，按該濃度1,25(OH)2D3設實驗組，同時設含10%胎牛血清的對照組，在6

6、孔板上培養(yǎng)，每組12個孔，每個孔2毫升DMEM/HIGH GLUCOSE基礎培養(yǎng)基，按照上述方法培養(yǎng)7天。七天后將實驗組及對照組各取3孔組成1個小組，共4組，依次用一抗(兔抗大鼠 Nestin IgG,1:100、兔抗大鼠 NF-200抗體,1:100、兔抗大鼠 GFAP多克隆抗體,1:125、兔抗大鼠 Gal單克隆抗體,1:100）標記，然后用適宜濃度的二抗染色。將各組熒光染色的細胞，在倒置熒光顯微鏡下選取適宜激發(fā)的光線觀察并照相。然

7、后將孔板中的細胞經酶消化、機械吹打法處理成單細胞懸液，調整細胞濃度為1.03105/ml，按照上述流式細胞儀檢測的方法處理細胞后，將各組細胞行流式細胞儀分析，依次統計各組細胞的比例變化。結果：（1）臺盼藍計數統計數據表明，正常對照組、含0.1%無水乙醇溶媒對照組和10-8mol/l1,25(OH)2D3間未見明顯統計學差異（P＞0.05），10-7和10-6濃度的1,25(OH)2D3能促進神經干細胞的增殖（P＜0.05），且10-6m

8、ol/l1,25(OH)2D3能使神經干細胞數量增殖最多，神經球體積更大、數量更多，但含1%無水乙醇的溶媒對照組和含10-5mol/l1,25(OH)2D3組細胞數量明顯下降，與正常對照比較有統計學意義（P＜0.05）。BrdU標記結果同臺盼藍染色結果類似。正常對照組、含0.1%無水乙醇溶媒對照組和10-8mol/l1,25(OH)2D3組間未見明顯統計學差異（ P＞0.05），10-6mol/l1,25(OH)2D3使神經干細胞增殖率

9、最高。10-5mol/l1,25(OH)2D3組與含1%無水乙醇的溶媒對照組細胞增殖率均明顯下降，而兩組均含有1%無水乙醇，考慮細胞損害與無水乙醇含量過高有關，故在下述實驗中將不再設置10-5mol/l的1,25(OH)2D3組。（2）1,25(OH)2D3促神經干細胞向少突膠質細胞分化實驗結果表明，溶媒對照組和胎牛血清分化對照組間未見明顯統計學差異（P＞0.05），而給予10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3處理

10、后，分化出的少突膠質細胞比例增加，與胎牛血清分化組比較均有統計學的意義（均 P＜0.05），且隨1,25(OH)2D3濃度的增加，1,25(OH)2D3促進NSCs向少突膠質細胞分化效果更加明顯，1,25(OH)2D3濃度的達到10-6mol/l時使NSCs向少突膠質細胞的分化比例達到最大值。在1,25(OH)2D3濃度的達到10-6mol/l時，NSCs經誘導分化后各類型細胞的比例分別為：少突膠質細胞30.48±2.31%、神經元26

11、.33±1.97%、星形膠質細胞30.58±2.03%、未分化的神經干細胞12.61±1.09%。結論：（1）1,25(OH)2D3具有促進NSCs增殖的作用，隨著濃度增加NSCs細胞增殖數量增加，且10-6mol/l1,25(OH)2D3能使神經球數量增多、體積明顯增大，神經干細胞增殖數量達到最大值。（2）1,25(OH)2D3具有促進NSCs向少突膠質細胞分化的生物學效應，隨著濃度增加少突膠質細胞分化比例增大，在10-6mol/l時

12、達到最大值，可使少突膠質細胞細胞的分化比例達到30.48±2.31%。
　　第二部分1,25(OH)2D3對缺血缺氧少突膠質細胞的保護作用
　　目的：構建少突膠質細胞體外缺血缺氧損傷模型，探討不同濃度的1,25(OH)2D3對缺血缺氧的少突膠質細胞的保護作用；方法：選用少突膠質細胞分化比例最高組1,25(OH)2D3的濃度是10-6mol/l，在25cm2培養(yǎng)瓶里誘導分化少突膠質細胞，獲取大量的細胞后，根據流式細胞儀檢測到的

13、熒光散射度或者發(fā)光度差異來分離細胞。將流式細胞儀分離提純后的少突膠質細胞加入無糖平衡鹽緩沖液調整到細胞濃度53105個/ml，分成7個實驗組，轉移到24孔板上每組6個孔，每孔500微升。A組：正常對照組（Normal control），僅含 DMEM/HIGH GLUCOSE完全培養(yǎng)基；B、C、D、E組：依次為含濃度10-9、10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3的無糖平衡鹽緩沖液；F組：缺血缺氧對照組，等量無糖的

14、平衡鹽緩沖液；G組，溶媒對照組：0.1%無水乙醇+無糖的平衡鹽緩沖液。其中缺血缺氧對照組、溶媒對照組和不同濃度的1,25(OH)2D3的實驗組將采用糖氧剝奪（ oxygen glucose deprivation，OGD）法構建少突膠質細胞的體外缺血缺氧損傷的模型培養(yǎng)6個小時，正常對照組則是在適宜條件下培養(yǎng)6個小時。通過MTT比色法及流式細胞儀檢測少突膠質細胞的細胞活力以及損傷凋亡狀況。結果：同正常對照組比較，缺血缺氧對照組及溶媒對照組

15、的少突膠質細胞的細胞活力明顯降低，細胞凋亡率明顯增高（均 P＜0.05），但缺血缺氧對照組與溶媒對照組組間比較上述指標無明顯差異（均P＞0.05）；而1,25(OH)2D3實驗組同缺血缺氧對照組比較，隨著1,25(OH)2D3濃度升高少突膠質細胞的細胞活力增強，凋亡率減少，差異具有統計學意義。但10-7mol/l1,25(OH)2D3組和10-6mol/l1,25(OH)2D3組相較差異不明顯（P＞0.05）；在增強細胞活力方面，10-