ZFP580及eNOS在小鼠心肌缺血模型中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的:
　　探討鋅指蛋白580(ZFP580)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在異丙腎上腺素(ISO)致小鼠心肌缺血模型中的表達(dá)情況，為闡明心肌缺血疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.將50只雄性成年昆明小鼠隨機(jī)分為5組，①對(duì)照組;②ISO，0.25mg/kg組，③ISO,1mg/kg組，④ISO,2.5mg/kg組，⑤ISO,5mg/kg組，每組10只。行ISO小鼠腹腔注射，在小鼠腹腔注射ISO后5

2、分鐘，采用BL-420生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，對(duì)參與試驗(yàn)的小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖進(jìn)行記錄，當(dāng)發(fā)現(xiàn)波形于ST段抬高，T波高聳，表現(xiàn)為典型心肌缺血心電圖波形，證明造模成功，繼而進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);處死小鼠前行摘眼球放血并收集血液，對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水后同法處死。
　　2.收集小鼠血清行生化指標(biāo)監(jiān)測(cè):主要生化指標(biāo)包括LDH及和CK活性數(shù)據(jù)。采用3000r/min對(duì)血清進(jìn)行離心處理，并利用分光光度計(jì)對(duì)上述兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.心肌組織

3、形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢查:對(duì)采集到的心尖部位組織進(jìn)行固定、脫水、包埋處理，利用對(duì)所制組織切片進(jìn)行觀察，獲取缺血心肌在形態(tài)上的變化情況。
　　4.定量RT-PCR檢測(cè)ZFP580mRNA及eNOS的表達(dá):通過對(duì)Trizol試劑的有效利用，完成對(duì)心肌中總RNA的提取工作。取所獲取的定量總RNA(400μg)10μl體系，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈。對(duì)cDNA模板(10μl)進(jìn)行簡(jiǎn)單處理后，再與靶基因ZFP580上下游引物融合，采用PCR對(duì)50

4、μl體系進(jìn)行反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照，監(jiān)測(cè)ZFP580及eNOS基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　5.心肌組織的染色觀察:對(duì)心肌組織進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色操作，并于顯微鏡下對(duì)著色情況進(jìn)行觀察。對(duì)其中陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，最低計(jì)數(shù)200個(gè)心肌細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞占視野內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比表示陽(yáng)性率。載玻片陽(yáng)性率取平均值。陰性對(duì)照:用0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟基本相同。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

5、表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（初步數(shù)據(jù)分析采用excel分析）。采用單因素方差表示組間差異，其中顯著性差異者用Student-Newmen-Kuels q檢驗(yàn)，并進(jìn)行兩兩比較。
　　結(jié)果:
　　1.ISO對(duì)小鼠ECG中ST段、T波及血清LDH、CK活性的影響
　　完成對(duì)小鼠的ISO腹腔注入后，小鼠表現(xiàn)為ST、T段抬升，表明小鼠出現(xiàn)典型的心肌缺血ECG改變，即模型制備成功。模型組小鼠LDH、CK活性兩項(xiàng)指

6、標(biāo)，較對(duì)照組有明顯提升(P＞0.5)
　　2.ISO對(duì)小鼠心肌形態(tài)學(xué)的影響
　　對(duì)心肌的形態(tài)學(xué)觀察，Masson染色顯示對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌免疫反應(yīng)著色為黃色。完成ISO注入后的實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌細(xì)胞排列相對(duì)紊亂，心肌多處呈現(xiàn)不規(guī)則壞死灶，并有明顯的炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)表現(xiàn)。缺血心肌染色為紅色。HE染色可見缺血心肌細(xì)胞核皺縮不規(guī)則，發(fā)生空泡樣變性。
　　3.小鼠缺血心肌細(xì)胞ZFP580mRNA及eNOS的表達(dá)
　　鋅

7、指基因ZFP580及eNOS在心肌缺血損傷中表達(dá)均降低，提示ZFP580及eNOS在心肌缺血發(fā)揮了某種調(diào)控功能，對(duì)心肌起保護(hù)作用。同時(shí)，研究結(jié)果顯示ISO可能影響心肌細(xì)胞中ZFP580的轉(zhuǎn)錄及其翻譯，其具體機(jī)制尚不完全明確。
　　4.小鼠缺血心肌細(xì)胞ZFP580蛋白及eNOS蛋白的表達(dá)
　　ZFP580定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，黃色染色細(xì)胞代表陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌的ZFP580陽(yáng)性細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯偏低。eNOS蛋