ZFP580在TGF-β1抗化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的:缺氧是許多臨床常見疾病的共同病理生理過程，當(dāng)機(jī)體尤其是心臟和大腦等重要器官遭受嚴(yán)重缺氧時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。氯化鈷作為一個(gè)廣為人知的缺氧模擬劑，它可以通過增加活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、降低細(xì)胞活力、改變線粒體膜電位、激活Caspase-3和誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生缺氧/缺血性應(yīng)答。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞

2、外分泌型信號多肽，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡，在生物體的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1在心臟保護(hù)中的作用也一直是研究的熱點(diǎn)，諸多報(bào)道表明其在心肌細(xì)胞損傷中通常扮演抗凋亡的角色。大鼠ZFP580是由本組克隆的一種C2H2型鋅指蛋白，前期研究表明TGF-β1可誘導(dǎo)其表達(dá)，且ZFP580在缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中具有促進(jìn)細(xì)胞存活及抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用。然而，ZFP580在H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷中是

3、否具有類似作用及具體機(jī)制，以及是否受到TGF-β1的調(diào)控仍不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過氯化鈷處理H9c2心肌細(xì)胞建立化學(xué)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，探究ZFP580在TGF-β1抗H9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)效應(yīng)中的作用及具體機(jī)制。
　　方法:MTT法檢測細(xì)胞存活率;Real time-PCR測定ZFP580和HIF-1α的mRNA表達(dá)水平;Western-blot檢測ZFP580、HIF-1α、Smad2、Smad3、p-Sma

4、d2、p-Smad3、Bax、Bcl-2和Active Caspase-3的蛋白表達(dá);AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡;DCFH-DA檢測活性氧生成;使用SB431542阻滯劑及慢病毒干擾技術(shù)后檢測相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1氯化鈷處理降低細(xì)胞存活率并上調(diào)ZFP580和HIF-1α的表達(dá)
　　氯化鈷可呈時(shí)間和劑量依賴方式降低細(xì)胞存活率。給予H9c2心肌細(xì)胞不同劑量的氯化鈷(400、600、800、100

5、0μM)處理24 h，細(xì)胞存活率隨著氯化鈷濃度的升高而降低，結(jié)果顯示600μM氯化鈷處理24 h時(shí)細(xì)胞存活率接近50％。然后使用600μM氯化鈷分別處理細(xì)胞0、4、8、12、16、20和24 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率與對照組相比在8、12、16、20和24 h顯著降低(P＜0.05)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot的結(jié)果顯示，氯化鈷能在mRNA和蛋白水平促進(jìn)ZFP580的表達(dá)，其mRNA表達(dá)高峰在12h早于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的峰值

6、16h。而HIF-1α蛋白迅速積累且表達(dá)峰值在12h，但在mRNA水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)HIF-1α的顯著改變。
　　2 TGF-β1減弱氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性并上調(diào)ZFP580蛋白的表達(dá)
　　為了進(jìn)一步探討在缺氧狀態(tài)下TGF-β1的作用，在暴露于氯化鈷相應(yīng)時(shí)間前給予TGF-β1預(yù)處理。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與各自相對應(yīng)的單純?nèi)毖踅M相比，TGF-β1預(yù)處理16h和24 h明顯減弱氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，提高細(xì)胞存活率達(dá)到約10％(P＜0.05

7、)。Western blot結(jié)果顯示常氧條件下TGF-β1刺激8、16和24 h后ZFP580的表達(dá)顯著升高。同時(shí)，我們注意到暴露氯化鈷處理前使用TGF-β1預(yù)處理也可以誘導(dǎo)ZFP580蛋白表達(dá)的上調(diào)。與各自相對應(yīng)的單純?nèi)毖踅M相比，TGF-β1預(yù)處理8h和24 h處ZFP580的表達(dá)上調(diào)明顯改變，尤其是在24 h時(shí)間點(diǎn)處(P＜0.05)。然而，在16h時(shí)間點(diǎn)上，TGF-β1預(yù)處理的細(xì)胞與單純?nèi)毖醯募?xì)胞之間沒有觀察到ZFP580表達(dá)的差別

8、。
　　3抑制Smad2/3的活化減弱ZFP580蛋白表達(dá)和TGF-β1介導(dǎo)的抗氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
　　使用公認(rèn)的TβR1-Smad2/3選擇性抑制劑SB431542給予H9c2心肌細(xì)胞預(yù)處理，然后在暴露于氯化鈷前予以TGF-β1刺激。結(jié)果表明SB431542能部分阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的ZFP580表達(dá)上調(diào)。另一方面，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，與單純?nèi)毖踅M相比，TGF-β1預(yù)處理可以顯著降低的凋亡細(xì)胞的比例(P＜0.0

9、5);與DMSO對照組相比，抑制Smad2/3的活化會(huì)使凋亡細(xì)胞的比例增加(P＜0.05)。
　　4 ZFP580在TGF-β1抗氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和ROS生成中的作用
　　為了探討ZFP580在抗氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡TGF-β1/Smad2/3信號傳導(dǎo)途徑中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染ZFP580干擾慢病毒下調(diào)ZFP580的表達(dá)，然后在暴露于氯化鈷前對細(xì)胞使用或不使用TGF-β1預(yù)處理。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，RNA干擾ZFP580

10、組與陰性對照組相比，細(xì)胞凋亡比例顯著增加(P＜0.05);當(dāng)轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞在暴露于氯化鈷之前預(yù)先用TGF-β1處理，RNA干擾ZFP580抑制其表達(dá)會(huì)明顯減弱TGF-β1的抗凋亡效果，凋亡細(xì)胞的比例顯著增加(P＜0.05)。共聚焦顯微鏡和酶標(biāo)儀的結(jié)果表明，缺氧條件下RNAi-ZFP580組與陰性對照組相比，細(xì)胞的活性氧顯著積累(P＜0.05)。同時(shí)TGF-β1預(yù)處理可以減少氯化鈷誘導(dǎo)的ROS生成。
　　5 ZFP580通過抑制線粒體

11、凋亡途徑參與了TGF-β1的抗凋亡作用
　　我們進(jìn)一步探討了ZFP580通過TGF-β1/Smad2/3信號傳導(dǎo)途徑抗氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。蛋白印跡的結(jié)果表明細(xì)胞預(yù)處理TGF-β1后，促凋亡分子Bax和活化的Caspase-3表達(dá)以及Bax/Bcl-2比率顯著降低，抗細(xì)胞凋亡的分子Bcl-2表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。同時(shí)，通過RNA干擾ZFP580抑制其表達(dá)后，TGF-β1的抗凋亡效果會(huì)被明顯減弱，Bax/Bcl-2比