酸性神經(jīng)酰胺酶在缺氧誘導肝癌細胞化療耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、目的：探討酸性神經(jīng)酰胺酶在缺氧誘導肝癌細胞多藥化療耐藥中的作用及機制，為闡明肝癌癌細胞獲得化療耐藥的機制及尋求克服肝癌化療耐藥新靶點提供理論依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用RT-PCR方法初步檢測21例肝癌患者肝癌組織、癌旁組織及多種肝癌細胞株、正常肝細胞株中ASAH1 mRNA表達情況，ImageJ軟件掃描灰度半定量法分析表達情況,初步探討酸性神經(jīng)酰胺酶在肝癌中表達特點。
　　（2）采用MTT法檢測肝癌細胞株Hep

2、G2在不同濃度梯度CoCL2(0、12.5、25、50、100、200、400umol/L)模擬缺氧環(huán)境下細胞增殖情況，確定HepG2最佳體外缺氧環(huán)境以進行后續(xù)試驗。
　?。?）MTT法檢測HepG2細胞在CoCL2誘導缺氧的條件下及常氧條件下對阿霉素、順鉑化療藥的敏感性， IC50計算軟件計算 IC50值；RT-PCR、Western-Blot法等檢測缺氧和常氧條件下HepG2細胞中酸性神經(jīng)酰胺酶及多藥耐藥基因-1表達水平，初步

3、探討缺氧誘導肝癌細胞產(chǎn)生耐藥的生物學機制。
　　（4）采用酸性神經(jīng)酰胺酶抑制劑NOE靶向抑制酸性神經(jīng)酰胺酶，MTT法檢測HepG2細胞在常氧和缺氧環(huán)境下對化療敏感性改變，RT—PCR、Western-Blot法等檢測酸性神經(jīng)酰胺酶及多藥耐藥基因-1表達水平，探究靶向酸性神經(jīng)酰胺酶在逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥中作用及機制。
　　結(jié)果：
　　(1)RT-PCR結(jié)果顯示：在21例肝癌患者組織標本中，有12例患者肝癌組織中 ASAH1

4、mRNA表達明顯高于對應的癌旁組織,21例肝癌組織ASAH1mRNA平均表達水平顯著高于21例癌旁平均水平，半定量差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。ASAH1 mRNA表達在三種肝癌細胞株中表達水平明顯高于兩種正常肝細胞株。
　　(2)CoCL2濃度梯度在12.5、25、50、100umol/L下， HepG2細胞增殖情況與常氧條件下沒有統(tǒng)計學差異，當CoCL2濃度在200、400umol/L條件下，細胞增殖能力明顯減弱（p<0

5、.05），因而HepG2細胞在100umol/LCoCL2條件下能夠較好耐受缺氧且增殖能力不受影響。
　?。?）HepG2細胞在100umol/L CoCL2模擬的缺氧條件下對阿霉素、順鉑的化療敏感性明顯降低，缺氧條件下對阿霉素IC50值為2.85umol/L,明顯高于常氧條件下IC50值1.39 umol/L,差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；缺氧條件下對順鉑IC50值為325.82umol/L,明顯高于常氧條件下IC50值1

6、84.18 umol/L，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PCR、Western-blot結(jié)果顯示酸性神經(jīng)酰胺酶、多藥耐藥基因-1在缺氧8h和24h條件下mRNA、蛋白水平表達水平高于常氧條件下的表達水平。
　?。?）NOE靶向抑制酸性神經(jīng)酰胺酶能夠增加細胞在缺氧條件下對阿霉素、順鉑化療的敏感性，并且明顯下調(diào)常氧和缺氧條件下酸性神經(jīng)酰胺酶、多藥耐藥基因-1 mRNA、蛋白水平表達。
　　結(jié)論：
　　（1）酸性神經(jīng)酰

7、胺酶基因在肝癌中表達升高，可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。
　?。?）CoCL2濃度為100umol/L時對HepG2細胞可以最大限度的誘導細胞缺氧而對細胞增殖能力無明顯影響。
　?。?）100umol/L CoCL2誘導的缺氧條件下 HepG2細胞對阿霉素、順鉑化療敏感性明顯降低，缺氧誘導酸性神經(jīng)酰胺表達升高，可能通過調(diào)控多藥耐藥基因-1的表達水平繼而使肝癌細胞獲得化療耐藥。
　?。?）靶向抑制酸性神經(jīng)酰胺酶可能通過下調(diào)多