Orexin-A對培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響及機制.pdf

1、第一部分：Orexin-A對培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響
　　目的:Orexins即食欲素,是一對興奮性神經(jīng)肽激素的合稱,于1998年在大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)。以往其研究主要集中在食欲調(diào)節(jié)、睡眠覺醒以及能量代謝等功能性方面,對星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)作用研究很少。本文主要討論Orexin-A對培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響。
　　方法:用創(chuàng)傷愈合模型研究Orexin-A對培養(yǎng)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的作用,用免疫熒光方法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)

2、胞上Orexin受體的表達(dá)和分布。
　　結(jié)果:分別給予3nM,10nM,以及100nM的orexin-A,在作用0h、24h、48h通過共聚焦觀察細(xì)胞遷移狀態(tài),發(fā)現(xiàn)orexin-A呈濃度時間依賴性的促進(jìn)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移,其中orexin-A濃度為10nM,作用24h時,促進(jìn)作用最為明顯。進(jìn)一步通過細(xì)胞免疫熒光方法檢測了Orexin-A兩種受體OX1R和OX2R在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示OX1R和OX2R在大鼠

3、培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)。OX1R在胞漿和胞核均有表達(dá),OX2R則只在胞漿表達(dá),胞核分布很少。給予OX1R和OX2R抑制劑SB334867和TCSOX229預(yù)處理后,OX1R特異性拮抗劑SB334867能夠顯著抑制orexin-A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移,OX2R受體抑制劑TCSOX229則不起作用。
　　結(jié)論:orexin-A顯著促進(jìn)大鼠原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移,該作用是通過OX1R而非OX2R介導(dǎo)。
　　第二部分：Ore

4、xin-A影響培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的機制
　　目的:ERK1/2通路是細(xì)胞遷移的主要信號通路之一,其上游主要受鈣離子調(diào)節(jié),而已有報道,Orexin-A能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及CHO細(xì)胞胞內(nèi)鈣的增加,對ERK1/2通路也有激活作用,但是在星形膠質(zhì)細(xì)胞還沒有相關(guān)報道。本文主要探討Orexin-A促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移是否與胞內(nèi)鈣增加以及ERK1/2磷酸化等信號通路相關(guān)。
　　方法:用創(chuàng)傷愈合模型誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移,用

5、鈣離子熒光成像技術(shù)觀察胞內(nèi)鈣的變化,用western blotting實驗觀察各種通道抑制劑對ERK1/2磷酸化的影響。
　　結(jié)果:Orexin-A(10nM,10min)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞,p-ERK的表達(dá)顯著增加,ERK1/2通路抑制劑PD98059以及U0126能夠顯著抑制orexin-A對星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞30min,orexin-A不再能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/

6、2磷酸化。鈣離子熒光成像實驗發(fā)現(xiàn),給予10nM的orexin-A能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度增加。給予EGTA無鈣外液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫耗竭劑CPA和非選擇性SOCE(鈣庫耗竭誘導(dǎo)的外鈣內(nèi)流)抑制劑2-APB預(yù)孵育之后,顯著抑制orexin-A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣增加。但對于ERK1/2磷酸化的影響,僅僅只有EGTA和2-APB表現(xiàn)出抑制作用,CPA不起作用。同時,BAPTA-AM和2-APB也能顯著抑制Orexin-A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)

7、胞遷移。激活鈣離子的上游途徑PLC-IP3通路抑制劑U73122也顯著抑制Orexin-A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2的磷酸化和細(xì)胞遷移。鈣離子的下游激酶PKC非選擇性抑制劑GF109203X對Orexin-A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化也有抑制作用,進(jìn)一步分析其亞型則發(fā)現(xiàn),只有PKCα抑制劑G6976對Orexin-A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化和遷移有抑制作用,PKCδ抑制劑rottlerin無作用。
　　結(jié)