縫隙連接細(xì)胞間通訊對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧后處理的影響.pdf

1、目的：
　　1.觀察原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中縫隙連接(GJ)在缺氧/復(fù)氧損傷和缺氧后處理之間的差異。
　　2.運(yùn)用GJ工具藥，改變GJ功能后，觀察缺氧后處理對細(xì)胞保護(hù)作用的變化。
　　3.初步探討缺氧后處理保護(hù)作用的可能作用機(jī)制。
　　方法：
　　采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，取24 h新生SD大鼠大腦皮層，培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞純化后，通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白特異性免疫熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度。建立星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型

2、和缺氧后處理模型。采用細(xì)胞接種熒光示蹤法(Parachute Assay)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞間的熒光傳遞功能。MMT法檢測缺氧后處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響，采用Annexin V/PI雙染法和Hochest33258熒光染色法觀察HPO對H/R損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的影響。采用Western blot檢測缺氧后處理及調(diào)控GJ功能后，HPO對細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)的影響以及對細(xì)胞 Cx43蛋白和 Src激酶蛋

3、白表達(dá)的影響。通過免疫熒光法(Immunofluorescence Assay)檢測 HPO及調(diào)控 GJ功能對星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面Cx43蛋白表達(dá)的影響。最后通過siRNA特異性干擾Cx43蛋白，觀察其對H/R損傷和HPO的影響。
　　結(jié)果：
　　對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定后發(fā)現(xiàn)，熒光顯微鏡下占光鏡下星形膠質(zhì)細(xì)胞比例為95％以上，說明得到了高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　熒光示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，H/R組熒光傳遞

4、受體細(xì)胞數(shù)增加；較H/R組，HPO組熒光傳遞受體細(xì)胞數(shù)降低；較HPO組，用10μM GJ增強(qiáng)劑RA預(yù)處理24h后的HPO組熒光傳遞受體細(xì)胞數(shù)增加，用25μM GJ抑制劑oleamide預(yù)處理1 h后的HPO組熒光傳遞受體細(xì)胞數(shù)減少(p<0.01)。結(jié)果表明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，HPO可顯著降低H/R所致的GJ功能增強(qiáng)。
　　通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較正常對照組，H/R組細(xì)胞存活率降低0.370±0.027(p<0.01)；較H/R組

5、， HPO組細(xì)胞存活率增加0.180±0.096(p<0.05)；而較HPO組，使用 RA預(yù)處理的HPO組的細(xì)胞存活率降低0.188±0.049(p<0.05)，使用oleamide預(yù)處理的HPO組的細(xì)胞存活率增加0.186±0.089(p<0.05）。MTT結(jié)果說明HPO可以減少由H/R所導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低，而通過調(diào)控GJ功能，可以影響HPO的這種作用。
　　Annexin V/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞早期凋亡率為0.0

6、82±0.009，0.357±0.027，0.217±0.008，0.278±0.021和0.150±0.019。較正常對照組，H/R組的凋亡率明顯增加，而HPO可明顯抑制由H/R所引起的細(xì)胞凋亡(p<0.01)。在使用了GJ增強(qiáng)劑RA和GJ抑制劑oleamide預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率較HPO組分別增加和降低(p<0.01)。
　　Hochest33258熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率增加；進(jìn)行HPO后，

7、細(xì)胞凋亡率較H/R組降低；而較HPO組，使用RA預(yù)處理的HPO組的細(xì)胞凋亡率增加，使用oleamide預(yù)處理的HPO組的細(xì)胞凋亡率降低。
　　通過western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比， H/R組Bax/Bcl-2的比例增加(p<0.01)；在進(jìn)行后處理后，較H/R組，Bax/Bcl-2的比例降低(p<0.01)；與HPO組相比，用RA預(yù)處理的HPO組Bax/Bcl-2的比例增加(p<0.05)，用Olea預(yù)處

8、理的HPO組Bax/Bcl-2的比例降低(p<0.05)。另外，對caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，與空白對照組相比， H/R組 caspase-3剪切條帶表達(dá)增加(p<0.01)；與H/R組相比，HPO組caspase-3剪切條帶表達(dá)減少(p<0.01)；與HPO組相比，用RA預(yù)處理的HPO組caspase-3剪切條帶表達(dá)增加(p<0.01)，用Olea預(yù)處理的HPO組caspase-3剪切條帶表達(dá)減少(p<0.05)。與正常

9、對照組相比，H/R組Src激酶表達(dá)增加(p<0.01)，而經(jīng)過后處理后，Src激酶表達(dá)降低(p<0.01)。較HPO組，使用RA預(yù)處理的HPO組Src激酶表達(dá)增加(p<0.05)，使用oleamide預(yù)處理的HPO組的Src激酶表達(dá)減少(p<0.05)。
　　通過免疫熒光檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面Cx43蛋白表達(dá)可發(fā)現(xiàn)， H/R組，細(xì)胞膜Cx43表達(dá)較正常對照組異常增強(qiáng)，而HPO可顯著減少Cx43的表達(dá)。在用10μM GJ增強(qiáng)劑RA預(yù)

10、處理24 h后，HPO組的Cx43表達(dá)增加，而在用25μM GJ抑制劑oleamide預(yù)處理1 h后，HPO組Cx43表達(dá)減少。通過western blotting檢測并對條帶灰度值掃描并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，較空白對照組，H/R組Cx43蛋白表達(dá)增加。較H/R組，HPO組降低(p<0.01)。而與HPO組相比，RA預(yù)處理組蛋白表達(dá)增加(p<0.05)，Olea預(yù)處理組蛋白表達(dá)降低(p<0.05)。這說明GJ功能的改變有可能與Cx43蛋白表

11、達(dá)的變化有關(guān)。
　　采用siRNA干擾Cx43蛋白表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)，陰性對照組對細(xì)胞GJ功能、細(xì)胞存活率和凋亡率無顯著影響(p>0.05)，但與陰性對照組相比，Cx43-siRNA轉(zhuǎn)染組可顯著降低由 H/R導(dǎo)致的GJ功能增加(p<0.01)。與陰性對照組相比， Cx43-siRNA轉(zhuǎn)染組也顯著抑制了由 H/R導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低(p<0.01)，。Cx43-siRNA轉(zhuǎn)染組較陰性對照組，可顯著降低H/R導(dǎo)致的細(xì)胞早期凋亡率增加(p<0

12、.01)。Cx43-siRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低 H/R導(dǎo)致的細(xì)胞晚期凋亡率增加(p<0.01)。以上結(jié)果說明干擾Cx43蛋白，抑制GJ功能，可以抑制由H/R所致的細(xì)胞凋亡率增加。
　　結(jié)論：
　　1.缺氧后處理可以降低由缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞間GJ功能增強(qiáng)。
　　2.缺氧后處理對缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用可能與降低GJ功能有關(guān)。
　　3.改變GJ功能會影響缺氧后處理的保護(hù)作用。
　　4.降低GJ功能導(dǎo)