丙泊酚對發(fā)育期大鼠海馬星形膠質細胞的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　丙泊酚（2，6-雙異丙基苯酚）是目前臨床上廣泛應用的靜脈麻醉藥物，而且其廣泛應用于兒科（包括新生兒）麻醉、鎮(zhèn)靜等方面。在臨床工作中，圍術期應用丙泊酚鎮(zhèn)靜或麻醉的患兒常出現譫妄等神經行為異常的問題。因為丙泊酚產生麻醉效應的主要機制是激動中樞抑制性γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）受體和抑制興奮性N-甲基-D-天（門）冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體，而GAB

2、A和NMDA介導的神經元活性對哺乳動物的腦發(fā)育而言是必不可缺的，所以，應用于小兒鎮(zhèn)靜或麻醉的GABA激動劑極可能會干擾神經系統(tǒng)的發(fā)育成熟。經過長期的研究，這一觀點已得到了國內外眾多實驗的證實，但目前，還有某些關鍵機制尚未被發(fā)現，比如大腦中數量較多且與神經元突觸聯系最緊密的星形膠質細胞（主要的膠質細胞種類）中也存在大量的GABA受體，而且其在哺乳動物腦發(fā)育和認知方面有重要意義，但關于全麻藥對其作用機制的研究卻十分欠缺。
　　小分子R

3、NA（microRNA或miRNAs）是一類重要的內源性單鏈非編碼RNAs，其以特異性序列結合的方式下調靶基因活性或降解靶基因，從而調控基因的表達。近年來，大量研究證實miRNAs是動物早期胚胎、腦及神經發(fā)育的重要調控因子，提示miRNAs可能調控全麻藥物對發(fā)育大腦的影響。但國內外尚無從miRNAs的水平探究全麻藥物對發(fā)育大腦影響機制的報道，因此有必要深入探究miRNAs在未成熟神經細胞中的表達和功能研究，為靶向干預圍術期患兒認知功能損

4、傷提供理論基礎。本課題通過miRNAs在丙泊酚作用和正常的星形膠質細胞中的差異表達分析和特定miRNAs作用機制的闡釋，進一步加強全身麻醉藥對發(fā)育大腦影響的分子機制的認識。
　　方法：
　　一、丙泊酚可引起發(fā)育期大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞凋亡
　?。ㄒ唬嶒瀯游?br>　　SPF級7日齡的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體重10-15g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供。
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5、組
　　實驗動物隨機分為四組(n=20):A組:脂肪乳組（腹腔注射等體積）;B組:腹腔單次注射丙泊酚30 mg/kg，1h后處死;C組:腹腔單次注射丙泊酚30 mg/kg，8h后處死;D組:腹腔單次注射丙泊酚30 mg/kg，24 h后處死。另外，從每組剩余動物中隨機選擇5只大鼠行動脈血氣分析。
　?。ㄈ╇p重免疫熒光染色
　　分別在用藥1、8、24 h后用10％水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠，取材后制備冰

6、凍切片。然后，進行GFAP和Cleaved caspase-3的免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察染色效果。
　　（四）制備電子顯微鏡標本
　　將給藥后的大鼠用10％水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射，灌注固定成功后，斷頭取腦組織，在冰上剝離海馬。獲取的海馬組織經固定、水洗、脫水、包埋、聚合及干燥后利用電子顯微鏡觀察細胞超微結構的變化。
　　（五）統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析處理數

7、據，各組數據以均數±標準差（(x)±s）表示。各組間結果比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA followed byBonferroni test)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　二、丙泊酚對發(fā)育大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞miRNAs基因表達譜的影響
　?。ㄒ唬嶒瀯游?br>　　SPF級7日齡的新生SD大鼠，體重10-15 g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
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8、　將96孔板內培養(yǎng)的星形膠質細胞隨機分為6組，分別是正常細胞組、丙泊酚P1、2、3、4組。 P1-4組終濃度分別為0.9、5、10、20、50μg/ml。每組設置5個復孔，每孔100 ul，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)1h和48 h后收集，正常細胞可培養(yǎng)24 h后直接收集。
　　（三）星形膠質細胞培養(yǎng)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)鑒定
　　選取大鼠海馬組織。經剪碎→消化→鏡檢→中止→過濾→離心→漂洗→原代培養(yǎng)→傳代純

9、化后，調整細胞密度（0.5～1.0×103個/cm2）接種于預處理（多聚-L-賴氨酸）的培養(yǎng)瓶或96孔培養(yǎng)板內（內置1 cm的蓋玻片）。其中部分細胞行GFAP免疫染色，
　?。ㄋ模㎝TT法檢測細胞活性
　　在各組的細胞中加入MTT溶液，置培養(yǎng)箱中孵育4h后離心，小心吸棄上清。每孔再加入DMSO，然后在酶標儀上于490 nm波長測定各孔光吸收值，重復實驗3次，計算平均值。
　　（五）提取總RNA及質量評價
　　在傳

10、代細胞中加入含有0.9μg/ml和10μg/ml丙泊酚的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞，48 h和1h后收集細胞（正常細胞可培養(yǎng)24 h后直接收集）。加入Trizol液，反復抽吸均勻，在裝有裂解物的離心管中加入氯仿振蕩混勻，室溫下靜置3 min。離心后小心吸取上清液，加入異丙醇振蕩，室溫下靜置后離心，吸棄上清液。在獲取的RNA沉淀中加入70％的乙醇清洗后吸棄上清。最后，用Agilent2100生物分析儀檢測RNA純度，毛細管凝膠電泳法檢測RNA

11、完整性。
　?。┬酒瑨呙?br>　　微陣列實驗由LC Sciences公司進行。
　?。ㄆ撸┬酒Y果分析及驗證
　　對芯片掃描結果進行標準和深度數據分析后獲得顯著性差異表達miRNAs列表，然后，分別進行靶基因預測、GO、KEGG分析以及網絡結構圖構建。最后，采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量聚合酶鏈反應對前期獲得的miRNAs差異表達譜進行體外定量驗證。
　?。ò耍┙y(tǒng)計學分析
　　采用SPSS16

12、.0統(tǒng)計軟件分析處理數據，各組數據以均數±標準差（(x)±s）表示。各組間比較進行單因素方差分析(one-way ANOVA followed by Bonferronitest)，p＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。芯片的數據分析將p-value設置為0.1，每組芯片設置三次生物學重復。
　　三、 Rno-miR-665通過調控Bcl2l1抑制丙泊酚引起的發(fā)育期星形膠質細胞凋亡
　?。ㄒ唬嶒瀯游?br>　　SPF級7日齡的

13、新生Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體重10-15g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供。
　　（二）星形膠質細胞培養(yǎng)及膠質纖維酸性蛋白（GFAP）鑒定
　　同論文二相應部分。
　　結果：
　　一、丙泊酚可引起發(fā)育期大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞凋亡
　?。ㄒ唬┭獨夥治鼋Y果
　　各組大鼠的血氣分析結果顯示pH、PaO2、 PaCO2、HCO3-、BE、SaO2差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.0

14、5，n=5)。
　?。ǘ╇p重免疫熒光染色結果
　　新生7天大鼠腹腔單次注射丙泊酚(30 mg/kg)8 h和24 h后，海馬星形膠質細胞內的GFAP熒光強度增大，Cleaved caspase-3表達增多，且24 h增多最為明顯;在丙泊酚單次給藥24 h后，GFAP/Cleaved caspase-3雙標陽性細胞數最多(#p＜0.05,##p＜0.01vs.propofol1h)(n=15)。
　?。ㄈ╇婄R結果

15、r>　　新生7天大鼠單次腹腔注射丙泊酚30 mg/kg1 h、8h、24 h后海馬區(qū)星形膠質細胞超微結構出現了經典的凋亡性改變。丙泊酚30 mg/kg腹腔給藥1h后，星形膠質細胞核膜尚完整，異染色質少量邊集于核膜下，細胞器濃縮聚集。隨著作用時間的延長，核膜多處溶解直至完全破裂，異染色質濃縮邊集逐漸明顯，線粒體基質密度增高。
　　二、丙泊酚對發(fā)育大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞miRNAs基因表達譜的影響
　　（一）離體細胞培養(yǎng)及鑒定<

16、br>　　離體海馬區(qū)星性膠質細胞培養(yǎng)成功。同一視野下，免疫雙標的細胞純度＞95％可用于后續(xù)實驗。
　?。ǘ㎝TT檢測不同條件下丙泊酚對發(fā)育星形膠質細胞增殖的抑制作用
　　丙泊酚10、20、50μg/ml作用1h，丙泊酚0.9、5、10、20、50μg/ml作用48 h后，細胞活性明顯下降(**p＜0.01 vs.control group)。
　　結論：
　　1.新生7天大鼠腹腔單次注射丙泊酚30mg/kg1

17、h，8h和24 h可顯著增加海馬區(qū)星形膠質細胞的凋亡率，提示丙泊酚可干擾神經細胞的發(fā)育成熟。
　　2.通過對丙泊酚作用后miRNAs微流體芯片的深入分析，證實嚙齒類動物發(fā)育大腦多個顯著性變化的miRNAs與神經發(fā)育過程密切相關，而且，這些miRNAs所對應的靶基因涉及到多個凋亡性通路的激活。因為預測靶基因含有Notch1和Bcl2l1(即Bcl-xl)的rno-miR-665在用藥后表達量顯著上升，這二者恰恰是凋亡抑制基因，所以選