骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)旁分泌角化細(xì)胞生長因子(KGF)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠肺泡上皮細(xì)胞(MLE12)損傷的修復(fù)作用及機(jī)制.pdf

1、背景：急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指是由感染、機(jī)械刺激、休克、輸血等病因?qū)е碌姆蚊?xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮彌漫性損害，以急性頑固性低氧血癥為臨床表現(xiàn)的急性呼吸衰竭,目前尚無有效治療手段改善ARDS的病死率。動物及細(xì)胞研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)通過歸巢、移植再生作用、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)肺泡液

2、清除率、改變肺血管內(nèi)皮通透性及其他機(jī)制促進(jìn)肺損傷修復(fù)，為ARDS早期治療提供新思路。前期研究發(fā)現(xiàn)，MSC能明顯修復(fù)LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺上皮損傷，同時伴有肺泡灌洗液中KGF水平明顯增加，而KGF能影響肺上皮細(xì)胞的生長、分化和成型，因此可以推斷MSC可能通過旁分泌KGF修復(fù)ARDS肺上皮損傷，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)了RAGE對于肺上皮的重要修復(fù)作用，因此上皮細(xì)胞的RAGE可能是KGF發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子。
　　目的：本研究擬在體外BM

3、SC與肺泡上皮細(xì)胞間接共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，通過干預(yù)MSC的RAGE表達(dá)，探討ARDS時BMSC旁分泌KGF對肺泡上皮修復(fù)作用，以及上皮細(xì)胞的RAGE在BMSC旁分泌KGF對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮損傷修復(fù)中起到的作用，從而更好的理解MSC治療ARDS的機(jī)制，為今后改善MSC對ARDS的治療效果提供新的研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.建立LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞損傷模型、體外間接共培養(yǎng)實驗?zāi)Ｐ图凹?xì)胞處理
　　細(xì)胞分組如下：

4、空白組：MLE12單獨(dú)培養(yǎng)；損傷肺泡上皮細(xì)胞組：MLE12加入LPS孵育；間接共培養(yǎng)對照組：MLE12與MSC間接共培養(yǎng)；間接共培養(yǎng)損傷組：MLE12與MSC間接共培養(yǎng)加入LPS孵育；KGF組：MLE12加入LPS孵育，加入KGF；RAGE抗體組：MLE12與MSC共培養(yǎng)加入LPS加RAGE抗體。
　　2.標(biāo)本的采集和檢測：間接共培養(yǎng)1d，3d或7d后，收集MLE12細(xì)胞，應(yīng)用western blot方法測定細(xì)胞中RAGE，ZO-

5、1的含量；收集三個時間點(diǎn)的培養(yǎng)基，應(yīng)用ELISA方法測定培養(yǎng)基上清液中KGF，RAGE的含量。
　　3.統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，變量以均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示，多組計量資料間比較采用Bonferroni校正檢驗分析，以P<0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.MSC對肺上皮損傷有修復(fù)作用。在1d、3d、7d的3個時間點(diǎn)，各組MLE12表面的ZO-1表達(dá)，WB結(jié)果顯示損傷組較

6、空白對照組相比ZO-1蛋白表達(dá)量下降（P<0.05）；間接共培養(yǎng)損傷組較間接損傷組相比ZO-1蛋白表達(dá)量增加（P<0.05），KGF組較損傷組相比ZO-1蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.05）；
　　2.MSC修復(fù)上皮損傷，可能通過旁分泌KGF。在1d、3d、7d的3個時間點(diǎn)，各組條件培養(yǎng)基KGF表達(dá)，ELISA結(jié)果顯示損傷組較空白對照組相比，培養(yǎng)基上清液中KGF因子表達(dá)量下降（P<0.05）；間接共培養(yǎng)損傷組較損傷組相比，培養(yǎng)基上清

7、液中KGF因子表達(dá)量增加（P<0.05）。
　　3.MSC旁分泌KGF修復(fù)上皮損傷可能與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的RAGE表達(dá)有關(guān)。在1d，3d的時間點(diǎn)各組上皮細(xì)胞 RAGE表達(dá)，WB結(jié)果顯示間接共培養(yǎng)損傷組較損傷組相比，RAGE蛋白表達(dá)量有所上升（P<0.05）；損傷組基礎(chǔ)上加入KGF的KGF組較損傷組相比，RAGE蛋白表達(dá)量明顯增加（P<0.05）。
　　在1d、3d、7d的3個時間點(diǎn)，各組條件培養(yǎng)基中RAGE的表達(dá)，ELISA結(jié)果

8、顯示損傷組較空白組相比，培養(yǎng)基上清液中RAGE因子表達(dá)量下降（P<0.05）；間接共培養(yǎng)損傷組較間損傷組相比，培養(yǎng)基上清液中RAGE因子表達(dá)量上升（P<0.05）；損傷組基礎(chǔ)上加入KGF的KGF組較損傷組相比，培養(yǎng)基上清液中RAGE因子表達(dá)量明顯上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.BMSC對LPS誘導(dǎo)MLE12細(xì)胞損傷有修復(fù)作用。
　　2.BMSC旁分泌產(chǎn)生KGF因子在修復(fù)LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞損傷有重要作用，是肺泡上皮