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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:膿毒癥常被定義為機(jī)體的廣泛炎癥,常表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征,死亡率居高不下。膿毒癥時(shí),細(xì)菌的組成部分和大量的宿主衍生的介質(zhì)會(huì)使血管內(nèi)皮屏障損傷,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制、活化異常和凋亡,引起組織水腫和器官功能障礙,是引起多器官功能不全和死亡的關(guān)鍵原因。新近研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)可以穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)缺血區(qū)血管的生成,提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中極可能具有應(yīng)用價(jià)值。本項(xiàng)目通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),從細(xì)胞治療
2、學(xué)角度探討B(tài)MSC對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng),為BMSC在膿毒癥治療中的應(yīng)用提供理論支持。此外,通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β、Smad4的表達(dá),從正反兩方面論證TGF-β/Smad4信號(hào)通路在BMSC保護(hù)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用,更加深入認(rèn)識(shí)BMSC對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。
方法:體外分離ICR小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,在含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)一:觀察LPS刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖、活化
3、和凋亡的改變,了解LPS介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的時(shí)效和量效關(guān)系;LPS刺激后,以BMSC干預(yù),觀察不同時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化和凋亡的改變情況,探討B(tài)MSC對(duì)LPS介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)二:以BMSC干預(yù)LPS刺激后的血管內(nèi)皮細(xì)胞,檢測(cè)TGF-β、Smad4蛋白和基因水平的表達(dá);采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)TGF-β和Smad4表達(dá)后,觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化和凋亡的改變情況,從正反兩方面論證TGF-β/Smad4信號(hào)通路在B
4、MSC保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
結(jié)果:
1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用:(1)與對(duì)照組相比,100ng/ml和1000ng/ml LPS作用24h或48h后,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力顯著減弱(P<0.05或P<0.01),E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌增加(P<0.05或P<0.01),內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增多(P<0.05)。但是與100ng/ml組相比,1000ng/ml
5、組血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力,E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌,以及細(xì)胞凋亡均無(wú)顯著性變化。(2)與LPS組相比,BMSC作用12h后,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡以及E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌無(wú)顯著性變化(P>0.05);在24和48h時(shí)間點(diǎn),BMSC干預(yù)后,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性升高,細(xì)胞凋亡以及黏附分子E-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、VCAM-1分泌明顯減低(P<0.05或P<0.01)。
6、
2.TGF-β/Smad4信號(hào)通路在BMSC保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用:(1)與24h、48h時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比,LPS刺激能夠顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4的表達(dá)(P<0.05或P<0.01);(2)與同時(shí)間點(diǎn)LPS組相比,BMSC作用24h和48h能夠顯著提高上清液中TGF-β水平,此外血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4表達(dá)均顯著提高(P<0.05或P<0.01);(3)與同時(shí)間點(diǎn)BMSC組相比,阻斷BMSC細(xì)胞TGF-β表達(dá)后,上清液
7、中TGF-β水平和血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4表達(dá)均明顯下降,同時(shí)BMSC對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用顯著受抑(P<0.05或P<0.01)。(4)與同時(shí)間點(diǎn)BMSC組相比,阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞Smad4表達(dá)能夠顯著下調(diào)BMSC對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)(P<0.05或P<0.01)。
結(jié)論:
1.LPS能夠劑量/時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖減低、凋亡增加和活化,在膿毒癥致病過(guò)程中,這一項(xiàng)效應(yīng)可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮和組織器官損傷的重要
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