Survivin蛋白在病毒性心肌炎中的表達(dá)及其抗凋亡作用.pdf

1、目的:觀察凋亡抑制因子生存素（survivin）在病毒感染不同時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，并初步探討survivin在病毒性心肌炎（viral myocarditis，VCM）中作用及其可能機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)新生Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，并予柯薩奇病毒B3(coxsachievirus B3，CVB3)感染原代心肌細(xì)胞，建立病毒性心肌炎細(xì)胞模型，觀察感染后心肌細(xì)胞的病變、搏動(dòng)情況改變，并用乳

2、酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)估心肌細(xì)胞損傷程度，運(yùn)用熒光定量PCR(RT-PCR)擴(kuò)增出CVB3的特異性條帶。復(fù)制VCM細(xì)胞模型，在CVB3感染心肌細(xì)胞0h、12h、24h、36h、48h、60h后，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)變化及CPE形成情況，通過(guò)RT-PCR和蛋白免疫印跡法（Western Blot，WB）兩種方式，檢測(cè)感染病毒不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞survivin表達(dá)的影響，應(yīng)用Anne

3、xinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，WB技術(shù)檢測(cè)cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量，對(duì)survivin表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率進(jìn)行相關(guān)性分析。通過(guò)構(gòu)建survivin基因過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞驗(yàn)證survivin在病毒性心肌炎中作用，將原代心肌細(xì)胞分為3組:正常對(duì)照組（未進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染），空病毒組（只攜帶GFP，不能過(guò)表達(dá)survivin），腺病毒組(既攜帶GFP，又能過(guò)表達(dá)survivin)，以正常細(xì)胞組作

4、為對(duì)照，檢測(cè)survivin過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)原代心肌細(xì)胞產(chǎn)生的影響及病毒轉(zhuǎn)染效果;將細(xì)胞分為3組:感染對(duì)照組（僅感染CVB3病毒），空病毒組（只攜帶GFP，不能過(guò)表達(dá)survivin），腺病毒組（既攜帶GFP，又能過(guò)表達(dá)survivin），于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第3天，將CVB3病毒感染細(xì)胞60h，以感染細(xì)胞組作為對(duì)照，觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)變化及CPE形成情況，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，WB技術(shù)檢

5、測(cè)蛋白cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量，探討surivin過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:1.原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈圓形、梭形或者多角形，邊界清晰，偽足明顯，胞質(zhì)及胞核亦清晰可見(jiàn)，呈自發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng)，在感染CVB3后，心肌細(xì)胞逐漸出現(xiàn)了細(xì)胞病變，感染48h心肌細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)團(tuán)縮變圓，搏動(dòng)減弱、不規(guī)則，至60h時(shí)大部分細(xì)胞脫壁、溶解，搏動(dòng)停止。感染CVB3病毒后心肌細(xì)胞毒性率較對(duì)照組顯著增高，RT-P

6、CR在感染組心肌細(xì)胞中擴(kuò)增出了CVB3的特異性條帶。2.正常心肌細(xì)胞存在survivin低表達(dá)，感染CVB3后，心肌細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)明顯增加，且呈時(shí)間依賴性，感染CVB3后12h，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，為表達(dá)最高峰（2.83±0.36）vs（1.03±0.21）(n=6)（P＜0.05），隨后survivin mRNA表達(dá)逐漸減少，于60 h時(shí)至最低點(diǎn)，甚至低于正常組（0.41±

7、0.18）vs（1.04±0.11）(n=6)（P＜0.05）。感染CVB3后，心肌細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)明顯增加，且呈時(shí)間依賴性，感染CVB3后12h，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，為表達(dá)最高峰（1.88±0.39）vs（1.08±0.07）(n=6)（P＜0.05），隨后survivin蛋白表達(dá)逐漸減少，60 h時(shí)至最低點(diǎn)，甚至低于正常組（0.47±0.41）vs（1.16±0.09）(n=6)（P＜

8、0.05）。
　　3.對(duì)照組心肌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)凋亡發(fā)生及cleaved-caspase-3表達(dá)，而感染CVB3病毒后實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)少量凋亡及cleaved-caspase-3表達(dá)，并且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase-3表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，凋亡率于感染60h達(dá)最高值（35.85％±3.76％）vs（0.25％±0.17％）(P＜0.05)，cleaved-caspase-3表達(dá)量也于感

9、染60h至高峰(3.46±0.23)vs(1.08±0.12)(P＜0.05)。
　　4.心肌細(xì)胞survivin基因表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率存在顯著負(fù)相關(guān)(r=0.718，P＜0.01);心肌細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率亦存在顯著負(fù)相關(guān)（r=0.727，P＜0.01）。
　　5.空病毒與腺病毒載體轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞活力和形態(tài)均未受到影響，腺病毒本身對(duì)原代培養(yǎng)的正常心肌細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性及影響。構(gòu)建的腺病毒能夠從mRNA和

10、蛋白水平有效改變?cè)囵B(yǎng)的心肌細(xì)胞survivin的表達(dá)(mRNA水平:過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染后，相對(duì)于對(duì)照組:1.03±0.32;空病毒組1.12±0.19，P＞0.05;腺病毒組:8.17±2.950，P＜0.05;蛋白水平:過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染后，相對(duì)于對(duì)照組:1.06±0.22;空病毒組0.94±0.13，P＞0.05;過(guò)表達(dá)病毒組:10.43±3.42，P＜0.05）。6.細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)survivin腺病毒后，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞損傷較感染對(duì)照組

11、明顯減小，心肌細(xì)胞病變積分較感染對(duì)照組明顯下降（感染對(duì)照組:2.79±0.64;空病毒:2.83±0.49;腺病毒:2.07±0.31，P＜0.05）;細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào)（感染對(duì)照組:39.67％±9.55％;空病毒:34.84％±6.14％，P＞0.05;腺病毒:25.43％±8.65％，P＜0.05）;cleavedcaspase-3表達(dá)明顯下調(diào)（感染對(duì)照組:1.05±0.12;空病毒:1.09±0.28，P＞0.05;腺病毒:0.